邵惠訓(xùn)

1988年，法國 Gluckman等采用臍帶血移植治療先天性再生障礙性貧血患兒以來，臍帶血作為造血干細(xì)胞（HSCs）代用品治療血液病備受人們關(guān)注[1]。臍帶血造血干細(xì)胞（umbilical cord blood hematopoietic stem cells，UCB-HSCs）移植成功，帶動(dòng)和拓展了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）和非常小類胚胎干細(xì)胞（very small embryonic-like stem cells，VSEL-SCs）移植的建立和應(yīng)用。本文著重論述 UCB-HSCs、UC-MSCs和VSEL-SCs 移植在臨床上的應(yīng)用。

1 UCB-HSCs、UC-MSCs和VSEL-SCs的來源與特性

胎兒是由生殖細(xì)胞精子和卵子結(jié)合形成的受精卵發(fā)育而成。受精卵發(fā)育分化成胚胎干細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過增殖和分化，形成各種組織器官，最后形成完整的人體。胚胎干細(xì)胞能誘導(dǎo)分化為人體各種細(xì)胞。HSCs 在體外能大量增殖，經(jīng)篩選、凍存和復(fù)蘇不會(huì)喪失其原有的活性。成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）存在于已經(jīng)分化的組織中，能自我更新，形成各種組織細(xì)胞。臍帶血是胎兒娩出，臍帶結(jié)扎離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。

UCB-HSCs、UC-MSCs和VSEL-SCs 移植是一種無痛苦、無創(chuàng)傷的治療方法。HSCs 移植后，除極少數(shù)患者有微熱和頭痛外，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。骨髓、外周血、臍帶血和臍帶都含有 HSCs，都具有較強(qiáng)增殖和多向分化能力。人體內(nèi)本來就有一定數(shù)量的內(nèi)源性干細(xì)胞，但都處于休眠狀態(tài)。當(dāng)臟器受到損傷時(shí)，內(nèi)源性干細(xì)胞遷徙聚集到受傷部位，活化處于休眠狀態(tài)的干細(xì)胞，分化為臟器功能細(xì)胞，修復(fù)受傷的組織和器官。然而，體內(nèi)內(nèi)源性干細(xì)胞數(shù)量極少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到使臟器修復(fù)、功能恢復(fù)的目的。因此，需要補(bǔ)充外源性干細(xì)胞，進(jìn)行 HSCs 移植[2-3]。

人類臍帶血和臍帶中含有比成人骨髓更豐富的HSCs和造血刺激因子，具有集落形成能力強(qiáng)，自我更新和增殖潛力強(qiáng)，細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)。HSCs 實(shí)際上就是 CD34+、CD38–細(xì)胞群。臍帶血和臍帶 CD34+、CD38–細(xì)胞的增殖分化能力高于骨髓，少量臍帶血就能滿足臨床移植之需。與骨髓和外周血相比，UCB-HSCs 來源豐富，采集方法簡便，采集臍帶血對(duì)供者和胎兒無任何傷害；HLA 配型相合程度要求低，能耐受部分組織相容性抗原差異，臍帶血移植物抗宿主病的發(fā)生概率很低；尋找 HLA 相合的臍帶血所需時(shí)間較短；HSCs 移植后，感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)很?。荒殠а械拿庖呒?xì)胞（T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和NK 細(xì)胞）發(fā)育不成熟，細(xì)胞表面的抗原性很弱，患者自身的免疫系統(tǒng)對(duì)未分化細(xì)胞識(shí)別能力很低，從而避免了 HSCs 移植引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)和超敏感反應(yīng)[4]。臍帶血中還存在多種非造血干細(xì)胞和前體細(xì)胞。UCB-HSCs、UC-MSCs和VSEL-SCs 移植較非親緣關(guān)系的骨髓移植更具優(yōu)勢(shì)，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景[5]。

UC-MSCs是一種成體干細(xì)胞，具備 T 細(xì)胞基本特性，來源于發(fā)育早期中胚層的多能干細(xì)胞，具有高度自我更新和多向分化能力，存在于骨髓造血微循環(huán)內(nèi)，支持骨髓 HSCs生長。UC-MSCs 很穩(wěn)定，無毒性，無致癌性，無免疫排斥作用[6]。在發(fā)育的不同階段和特定環(huán)境，可分化為多種細(xì)胞。UC-MSCs 在臍帶血中數(shù)量很少，可從臍帶分離培養(yǎng)[7]。UC-MSCs能分化為骨、軟骨、神經(jīng)、肝臟、骨骼肌、脂肪、內(nèi)皮和纖維細(xì)胞，應(yīng)用于組織損傷修復(fù)、基因治療和HSCs共移植。

VSEL-SCs 存在于骨髓和脂肪組織中，是一類稀少的多能干細(xì)胞，具有胚胎干細(xì)胞的典型特征，有再生成各種人體細(xì)胞的潛能[8-9]。在組織器官受損時(shí)，VSEL-SCs 可從骨髓釋放到血液循環(huán)，參與損傷臟器的修復(fù)?？捎?G-CSF 將骨髓中的VSEL-SCs 動(dòng)員釋放到外周血，通過血漿置換法收集。VSEL-SCs 可冰凍長期保存，以備將來醫(yī)療之需。VSEL-SCs 經(jīng)體外培養(yǎng)，可分化成各種三胚層細(xì)胞系。

2 UCB-HSCs的制備和移植程序

采集和保存臍帶血和臍帶的機(jī)構(gòu)需要通過衛(wèi)生部審批。在中心城市都應(yīng)建立臍帶血庫。年齡在18～35周歲的健康孕婦，懷孕期間各種檢測(cè)指標(biāo)正常，無孕期并發(fā)癥，都可作為采集臍帶血和臍帶的供體。孕婦入院時(shí)，必須攜帶臍帶血庫發(fā)給的臍帶血采集用具。孕婦分娩前提醒助產(chǎn)醫(yī)生協(xié)助抽取母血，采集臍帶血和臍帶，并通知當(dāng)?shù)啬殠а獛?。臍帶血庫?yīng)安排具有恒溫設(shè)備的收采臍帶血和臍帶的車輛，在18 h 內(nèi)前往孕婦待產(chǎn)醫(yī)院收取臍帶血和臍帶，以確保臍帶血和臍帶細(xì)胞活性。臍帶血庫在60個(gè)工作日內(nèi)確認(rèn)臍帶血和臍帶是否符合入庫儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)。臍帶血和臍帶在理論上可長期保存。

開展 UCB-HSCs 移植的醫(yī)院，應(yīng)具有質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)措施的臨床實(shí)驗(yàn)室和有細(xì)胞計(jì)數(shù)和HLA組織配型的檢測(cè)能力。HLA 在血清學(xué)上分為HLA-A、B、C和HLA-DR、DQ。同基因?qū)\生兄弟姐妹 HLA相合率為100%，異基因?qū)\生或親兄弟姐妹為1/4，人類非血緣關(guān)系的HLA相合率為1/400～1/10000。

用流式細(xì)胞儀從產(chǎn)婦臍帶血分選出CD34+和CD38–標(biāo)記的臍帶血原始細(xì)胞，在添加 IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、IGF-1和SCF 混合因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行增殖。

UCB-HSCs 一般采用靜脈輸入給受者。股骨內(nèi)注射能快速產(chǎn)生高水平的髓系和紅系細(xì)胞，值得關(guān)注。用雙份臍帶血移植可克服單份臍帶血細(xì)胞數(shù)量不足之虞。

3 UC-MSCs的制備和移植程序

在GMP 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將新鮮采集的臍帶剪成 1～2 mm3的組織塊，先后用 0.075% II 型膠原酶和0.125% 胰酶消化。消化產(chǎn)物經(jīng) 100 μm 濾器過濾，獲得細(xì)胞懸液。離心后重懸于5% 胎牛血清的LG-DMEM 培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)瓶內(nèi)，置CO2孵箱 37 ℃ 培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá) 80% 融合時(shí)，用0.25% 胰酶消化傳代。

移植用 UC-MSCs 為第 2～4 代細(xì)胞，經(jīng)靜脈輸注給受者。輸入的細(xì)胞數(shù)應(yīng)為1×106/kg 體重。

4 HSCs 移植的臨床應(yīng)用

4.1 抗衰老

通過體外 HSCs 移植，抑制衰老。輸入干細(xì)胞或活化體內(nèi)處于休眠狀態(tài)的干細(xì)胞，系統(tǒng)提高全身細(xì)胞更新能力和活性，改善組織和器官功能。HSCs 移植抗衰老最適合于中年人。在這一時(shí)期，人的衰老是可逆的。

播種小麥時(shí)，按照基肥施用硫酸鉀復(fù)合肥25公斤/畝的標(biāo)準(zhǔn)，各小區(qū)1.88公斤均勻施作基肥；按照9萬株/畝的基本苗，根據(jù)小麥種子038的千粒重和發(fā)芽率，以95%的出苗率計(jì)算用種量為4.6公斤/畝，計(jì)算到各區(qū)125克均勻撒播。

HSCs 移植用于隆胸、豐唇、隆下巴和皮膚除皺。干細(xì)胞植入人體后，經(jīng)血流遷徙到表皮，釋放出生長因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)膠原蛋白生長，使皮膚恢復(fù)彈性、白皙、富有光澤。保護(hù)真皮層成纖維細(xì)胞免受氧化游離和紫外線侵襲。HSCs 移植使皮下組織充盈，皮膚紅潤，皺紋和色素沉著減少。人的心情也變得舒暢、愉悅。干細(xì)胞美容尚處于研究實(shí)驗(yàn)階段，技術(shù)尚不成熟，事故常有發(fā)生。衛(wèi)生部食品藥品監(jiān)督管理局尚未批準(zhǔn)干細(xì)胞產(chǎn)品用于美容。

4.2 抗腫瘤

在人體免疫系統(tǒng)，有兩種專門抗擊腫瘤的細(xì)胞，一種是樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs），能激活人體免疫應(yīng)答，主動(dòng)搜索和識(shí)別腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤形成和擴(kuò)散；另一種是細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer，CIK）。DCs 由 CD34+和CD14+細(xì)胞產(chǎn)生，存在于骨髓、臍帶血、臍帶組織和外周血中，是人體內(nèi)功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，能誘導(dǎo)出抗原特異性細(xì)胞毒 T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），在腫瘤免疫治療中發(fā)揮著極其重要作用。CIK 細(xì)胞同時(shí)表達(dá) CD3+、CD56+兩種細(xì)胞膜蛋白分子，又稱為NK 細(xì)胞樣 T 細(xì)胞，能主動(dòng)識(shí)別和定向精確殺滅腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。而不損傷正常組織和細(xì)胞，對(duì)人體無毒副反應(yīng)。CIK 細(xì)胞是人體外周血或臍帶血在體外用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，是一種新型、高效、廣譜殺傷腫瘤的免疫效應(yīng)細(xì)胞。臍帶血 CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增快，殺傷腫瘤細(xì)胞活性強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用優(yōu)于外周血 CIK 細(xì)胞。

DCs 與CIK 共育，能相互調(diào)節(jié)，增加細(xì)胞因子釋放，使 CIK 細(xì)胞溶瘤活性顯著增強(qiáng)，對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用更加具有特異性，能大幅度提升人體免疫力。CIK 細(xì)胞擴(kuò)增效率高，抗擊細(xì)胞凋亡、殺滅腫瘤活性明顯高于LAK 細(xì)胞。腫瘤患者經(jīng)干細(xì)胞移植治療后，由于體內(nèi)尚有少量腫瘤細(xì)胞殘留，常引起腫瘤復(fù)發(fā)。DCs-CIK 細(xì)胞移植能防止微小殘留病作祟，殺滅殘留在血液和淋巴液內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。這就是 Steinman 與美國斯坦福大學(xué)創(chuàng)建的“CLS（care life of science）細(xì)胞免疫治療技術(shù)”。CLS 技術(shù)從根本上治療和控制腫瘤生長，防止腫瘤復(fù)發(fā)。Steinman 因此獲得了 2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在健康人體，DCs和CIK 細(xì)胞數(shù)量極少，在腫瘤患者體內(nèi)數(shù)量更少。在臍帶血和臍帶中，能分離到這兩種細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)和活化，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，有效清除血液和淋巴液中殘存的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。適用于不同病期的腫瘤患者治療。DCs-CIK 細(xì)胞移植與手術(shù)治療、放療和化療聯(lián)合使用，效果更加顯著。CLS 技術(shù)在美國的臨床實(shí)驗(yàn)表明，提高了腫瘤患者 5年生存率近一倍，這標(biāo)志著腫瘤患者的命運(yùn)已被改寫，對(duì)于改善患者生活質(zhì)量具有重大意義[10-13]。

HSCs 移植在治療多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、白血病、肺癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌和其他惡性腫瘤方面取得了良好效果[14]。2010年4 月 29 日，美國 FDA 批淮了DCs 疫苗治療前列腺癌。DCs-CIK 細(xì)胞共育，能提高 CIK細(xì)胞對(duì) SMMG-7721 肝癌細(xì)胞的殺傷力，其殺滅腫瘤作用比單純 CIK 細(xì)胞更強(qiáng)。應(yīng)用腎癌細(xì)胞裂解物的DCs 細(xì)胞疫苗聯(lián)合 CIK 細(xì)胞治療晚期腎癌患者，能誘導(dǎo)特異的抗腎癌免疫反應(yīng)。

艾輝勝團(tuán)隊(duì)建立的微移植療法治療急性髓性白血病取得了重大進(jìn)展?；颊呓邮芪⒘炕熀?，輸入造血干細(xì)胞，能激發(fā)患者自身免疫系統(tǒng)，還能清除患者體內(nèi)殘存的癌細(xì)胞，降低了感染和罹患肺炎并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。微移植療法不受患者年齡和配型限制，為白血病和腫瘤患者提供了安全高效的新治療手段[15-16]。

4.3 治療自身免疫性疾病

機(jī)體對(duì)自身抗原缺乏免疫耐受而發(fā)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身組織損害，形成自身免疫性疾?。╝utoimmune disease，AID）。AID 患者病程遷延，致殘率高，生活質(zhì)量差，且無理想的治療方法?；颊唧w重降低、脾臟腫大、自身抗體形成、Th1和Th17 細(xì)胞增加，引發(fā)炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）。IBD 患者體內(nèi)正常組織遭受免疫系統(tǒng)攻擊，發(fā)生病變。局部皮膚潰爛，消化道出血。DCs能引發(fā) T 細(xì)胞免疫耐受功能，逆轉(zhuǎn)自身免疫反應(yīng)[17]。重建新的造血系統(tǒng)，皮膚潰爛的瘡口逐步愈合，消化道出血停止，癥狀得到改善。

HSCs 移植能治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）[18]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）、多發(fā)性肌炎/皮肌炎（polymyositis/dermatomyositis，PM/DM）和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）等自身免疫性疾病[19-20]。HSCs 移植能使疾病緩解，修復(fù)受損臟器，改善疾病預(yù)后[21]。SLE是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原發(fā)生了免疫應(yīng)答，以多臟器損害和血液中出現(xiàn)多種自身抗體為特征。臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、體重減輕、肌肉關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。在顏面、頸部、軀干和手臂等部位出現(xiàn)皮疹。當(dāng)皮疹出現(xiàn)在鼻和面頰時(shí)，看起來像只蝴蝶，并伴有感染、出血、淋巴結(jié)腫大和毛發(fā)脫落等癥狀。預(yù)后不佳。兒童和女性多見。對(duì)非甾體類抗炎藥、潑尼松、甲氨蝶呤、環(huán)孢菌素 A和氯喹等治療效果不佳的RA 患者，經(jīng)自體干細(xì)胞移植后，病情明顯改善。在免疫重建中，患者的免疫調(diào)節(jié)功能達(dá)到新的平衡，產(chǎn)生了免疫耐受。SSc是一種皮膚和內(nèi)臟器官的纖維組織增生、硬化、萎縮的疾病。經(jīng)UC-MSCs 移植治療，能阻止病情發(fā)展。UCB-HSCs 治療EAE，能顯著改善 EAE 大鼠的神經(jīng)功能，并能在其腦和脊髓內(nèi)存活、遷徙和分化，減少脫髓鞘病灶[22]。

4.4 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能

4.5 治療造血系統(tǒng)疾病

對(duì)再生障礙性貧血、地中海貧血患者，給予大劑量化療或放療，將骨髓內(nèi)原有的HSCs 殺滅清除。再將配型相合的自體或異體 HSCs 移植。植入的干細(xì)胞在骨髓內(nèi)繁殖、復(fù)制，重建患者的造血系統(tǒng)及其功能。

4.6 治療代謝性疾病

1 型糖尿病患者胰島 β 細(xì)胞的損傷和凋亡是致病的主因。人體本來就有一定數(shù)量的內(nèi)源性干細(xì)胞，但處于休眠狀態(tài)。體內(nèi)內(nèi)源性干細(xì)胞數(shù)量不足以使胰島修復(fù)。因此，需要進(jìn)行 HSCs 移植，激發(fā)內(nèi)源性干細(xì)胞功能[23-24]。

4.7 治療下肢血管病變

干細(xì)胞移植治療糖尿病足、下肢動(dòng)脈閉塞性硬化癥和脈管炎等。糖尿病足患者下肢動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成，血管管腔變窄，甚至閉塞，造成缺血性壞死，最終導(dǎo)致患者截肢。經(jīng)自體 HSCs 移植，刺激新的側(cè)支循環(huán)形成，改善患肢血液供應(yīng)[25]。

4.8 治療神經(jīng)損傷和疾病

將 UC-MSCs 注射到患者脊髓腔內(nèi)，HSCs 進(jìn)入損傷部位，分泌出多種神經(jīng)生長因子，可治療脊髓損傷、小腦萎縮、帕金森病、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、脊髓炎后遺癥、腦梗死和腦癱等疾病[26]。腦梗死導(dǎo)致不可逆神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)破壞和膠質(zhì)細(xì)胞缺失，用成體神經(jīng)干細(xì)胞移植治療，有一定效果。遺傳性小腦共濟(jì)失調(diào)（hereditary cerebellar ataxia）經(jīng) UC-MSCs 移植治療，能延緩疾病發(fā)展，提高患者生活質(zhì)量。

4.9 治療心血管疾病

對(duì)急性心肌梗死患者，HSCs 移植能促進(jìn)心肌血管再生，建立側(cè)支循環(huán)，改善心臟功能[27]。

4.10 治療肝硬化

肝硬化是由一種或多種病因引起的肝臟損害，肝臟呈進(jìn)行性、彌漫性和纖維性病變，極易衍變?yōu)楦伟SCs 移植能促進(jìn)肝細(xì)胞再生，肝纖維化逆轉(zhuǎn)。患者越年輕，病程越短，并發(fā)癥越少，治療效果越好[28]。

4.11 治療男性不育

利用男性胚胎生精干細(xì)胞或皮膚細(xì)胞能制造出人工精子，為治療男性不育帶來希望。精原干細(xì)胞移植技術(shù)是將供體的干細(xì)胞移植到受體睪丸的精曲小管內(nèi)，使之重建生精功能。ESCs是一種無限增殖的細(xì)胞系，有成瘤、惡性變和感染潛在病毒的風(fēng)險(xiǎn)，其應(yīng)用存在生物安全隱患。再生醫(yī)學(xué)干細(xì)胞移植，尚有很長的路要走。

5 結(jié)語

臍帶血造血干細(xì)胞是人體組織來源的細(xì)胞，是一類具有自我更新能力的多潛能干細(xì)胞，能分化成多種功能性細(xì)胞，包括骨髓樣細(xì)胞（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹突狀細(xì)胞）和淋巴樣細(xì)胞（T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、CIK 細(xì)胞）。HSCs 移植對(duì)多種人類疾病可能具有治療價(jià)值，在醫(yī)學(xué)上有廣泛用途。近幾年來發(fā)展和衍化而來的UCB-HSCs、UC-MSCs和VSEL-SCs 移植，在人類多種疾病的治療研究中顯示了一定的治療作用，目前還需要進(jìn)行多中心，大樣本的臨床有效性和安全性評(píng)價(jià)，可能在未來發(fā)展成為一種新的臨床治療技術(shù)。

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