李雪冰 綜述 尤嘉琮 周清華 審校

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的腫瘤。全球每年大約有160萬的肺癌新發(fā)病例和140萬的肺癌死亡病例[1]。在美國肺癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位列第2位，而死亡率列第1位[2]。根據(jù)衛(wèi)生部2012年度腫瘤登記年報資料[3]顯示，我國2009年肺癌發(fā)病率為53.57/10萬，死亡率為45.57/10萬，即每年新發(fā)肺癌患者超過70萬，死亡超過60萬。

已有的研究[4,5]表明，肺癌發(fā)病原因與多種基因的突變密切相關，其中最為重要和典型的是抑癌基因p53的突變和原癌基因K-ras的突變。此外，約有40%-50%的肺腺癌中存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的異常高表達或激活突變，并且與較差的預后相關聯(lián)[6,7]。與非吸煙人群相比，p53和K-ras的突變比例在吸煙人群中略高；而EGFR的突變比例在非吸煙人群中遠高于吸煙人群[8]。因此，以這些基因作為靶點尋找治療肺癌的方法具有很強的可行性。此外，還有一種重要的腫瘤微環(huán)境因素-低氧（hypoxia），對肺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。因此，本文將近年來低氧與肺癌相關性的研究進展綜述如下。

1 低氧的概念

腫瘤是非單一細胞的實體，從總體上看包括腫瘤細胞和間質，而間質又主要包括血管、淋巴管、結締組織、炎癥細胞和細胞外基質等。此外，可溶性分子O2還參與腫瘤細胞附近的間質動態(tài)變化，促進腫瘤的惡性化[9]，他們共同組成了腫瘤的微環(huán)境。機體各組織器官的氧分壓明顯低于標準大氣壓160 mmHg，且各器官并不同，其中由高到低分別為：肺110 mmHg，脾66 mmHg，心25 mmHg，腎25 mmHg，腦24 mmHg，肝24 mmHg[10]。低氧是指可利用氧的減少或氧分壓降至臨界值以下的狀態(tài)，這種狀態(tài)會限制甚至終止器官、組織和細胞的生理功能[11]。低氧可以由多種因素造成[11]，而低氧常發(fā)生在急慢性血管性疾病、肺部疾病和腫瘤中[12]。

2 肺癌低氧微環(huán)境的發(fā)現(xiàn)

其實，早在50多年前，Thomlinson和Gray[13]就在距血管180 μm的地方觀察到了腫瘤壞死，他們推測這是腫瘤細胞過度增殖使其將血氧完全耗盡的位置，這是人類首次開創(chuàng)性地觀測并推斷了腫瘤低氧微環(huán)境的存在。此后，H?ckel等[14]也利用氧電極在頭頸部、頸椎腫瘤和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了低氧存在，并且與腫瘤患者的低存活率和腫瘤的高轉移性均具有相關性。后續(xù)的研究[15]發(fā)現(xiàn)，放療過程中氧氣可以被激發(fā)而產生自由基，殺傷腫瘤細胞，但處于低氧區(qū)的腫瘤細胞由于缺乏氧氣，自由基產生較少，從而對放療產生抵抗作用。直到2006年，Le等[16]才在肺癌患者體內檢測到了肺癌組織低氧氣分壓的存在，并且與較差的預后相關，這是迄今為止唯一關于檢測到肺癌組織低氧的報道。

3 低氧的信號通路

隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)低氧會通過一個能夠感受并應對低氧的重要轉錄因子-低氧誘導因子（hypoxia inducible factor, HIF），對腫瘤產生多方面的影響。HIF是由Semenza等[17]在研究低氧加速紅細胞成熟時發(fā)現(xiàn)的。它是一個由受氧調節(jié)的α亞基與穩(wěn)定表達的β亞基組成的異源二聚體。在常氧條件下，HIF-α蛋白上兩個關鍵位置的脯氨酸會被脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain,PHD）羥化，使其可被希佩爾·林道病基因產物（product of von Hippel-Lindau gene, pVHL）識別并結合，進而被pVHL降解復合物泛素化降解；而在低氧條件下，PHD活性受到抑制，HIF-α無法被羥基化，從而無法被pVHL識別、結合并介導降解，HIF-α便會大量積累，結合HIF-1β，入核發(fā)揮轉錄因子的功能，在腫瘤的血管生成、細胞生存、增殖、凋亡、轉移、浸潤和代謝等方面發(fā)揮重要的作用。而在2009年HIF也被發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中轉錄水平上高表達，并且與較差的預后相關聯(lián)[18]。此后，越來越多的研究[19]證明低氧和HIF有可能成為治療肺癌的一個十分重要的靶點。

4 低氧信號通路對肺癌的作用

低氧可以通過減少自由基產生，從而對肺癌的放療產生抵抗作用。而低氧對肺癌的影響遠不止這些，Minakata等[20]發(fā)現(xiàn)在EGFR突變的非小細胞肺癌中，低氧可以通過上調轉化生長因子（transforming growth factor alpha, TGF-α）來激活野生型EGFR，從而使肺癌細胞產生對吉非替尼的耐藥性；Ouyang等[21]還發(fā)現(xiàn)低氧可以上調骨膜蛋白（periostin）的表達，通過激酶Akt/PKB信號通路提高肺癌細胞的生存能力。其實，低氧相關信號分子如低氧誘導因子HIF、脯氨酸羥化酶PHD和希佩爾·林道病基因產物pVHL均會通過多條途徑對肺癌的發(fā)生發(fā)展產生影響而發(fā)揮更加重要的作用。

4.1 HIF對肺癌的作用 HIF由α和β兩個亞基組成。在哺乳動物中，HIF-α存在三種亞型，HIF-1α和HIF-2α在結構和功能上相似性較大，而HIF-3α研究較少，有報道[22]認為它可能作為HIF-1α和HIF-2α的負調控元件。HIF-1α在幾乎所有類型的細胞中均有表達，而HIF-2α和HIF-3α的表達則具有一定的組織局限性[23]。研究表明，低氧可以通過HIF-1α或HIF-2α對肺癌產生重要影響。

4.1.1 HIF在肺癌組織中高表達 早在1999年Zhong等[24]通過大量的免疫組化染色實驗發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在19種腫瘤的13種中呈現(xiàn)高表達，其中包括肺癌。2000年Volm等[25]在96例非小細胞肺癌標本中對HIF-1α和HIF-1β進行了免疫組化染色，他們發(fā)現(xiàn)HIF-1陽性患者的平均存活時間明顯高于HIF-1陰性患者，提示與較好的預后有關聯(lián)。2001年Giatromanolaki等[26]應用免疫組化染色對HIF-1α或HIF-2α進行的檢測，結果顯示二者分別在62%和50%的非小細胞肺癌病例中高表達，并且與多種血管生長因子的表達呈正相關。但與之前的報道相反，他們發(fā)現(xiàn)HIF-1α與較差的預后相關聯(lián)。2009年Yohena等[18]通過實時熒光定量PCR手段在肺癌組織中發(fā)現(xiàn)了HIF-1α在轉錄水平上的高表達，這與之前報道的蛋白水平結果相一致，同時他們也發(fā)現(xiàn)HIF-1α與較差的預后密切相關。

4.1.2 HIF對肺癌細胞增殖和凋亡的影響 2006年Zhang等[27]在肺腺癌A549細胞中外源性地表達了HIF-1α，他們發(fā)現(xiàn)，與對照細胞相比表達HIF-1α的A549細胞可以通過上調多藥耐藥基因MDR-1，抵抗由5-氟尿嘧啶誘導的細胞凋亡。Kamlah等[28]在LLC1肺腺癌模型小鼠中，利用頸靜脈siRNA注射技術，同時沉默HIF-1α和HIF-2α的表達，發(fā)現(xiàn)進行基因沉默的肺癌模型小鼠存活時間明顯增長，并且免疫組化顯示腫瘤的增殖明顯減慢，血管生成和凋亡也都明顯減少。同年，Chen等[29]從大量的非小細胞肺癌組織標本出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了HIF-1α與凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族成員蛋白survivin表達的正相關性，并在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以在轉錄水平調節(jié)survivin的表達，從而抑制肺癌細胞的凋亡。HIF-1α在小細胞肺癌中的作用是由Wan等[30]報道，他們通過直接低氧、基因過表達和基因沉默三種手段改變HIF-1α的表達，并進行基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以促進細胞因子信號傳導抑制蛋白-1（suppressor of cytokine signaling, SOCS1）基因的表達，而SOCS1可以促進小細胞肺癌NCI-H446細胞的凋亡并抑制其生長。這一結果首次揭示了HIF-1α在小細胞肺癌中的特殊調節(jié)機制，即通過SOCS1基因對自身的促癌作用進行負反饋調節(jié)。Mazumdar等[31]也利用K-ras（G12D）肺癌小鼠模型，揭示了HIF-2α的兩面作用，他們提出HIF-2α不僅能夠促進肺癌的發(fā)展，還能通過調節(jié)抑癌基因，發(fā)揮抑制肺癌的作用。以上這些報道表明，HIF在低氧加速肺癌進程的過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

4.1.3 HIF在肺癌細胞侵襲轉移中的作用 2007年Shyu等[32]在利用不同侵襲能力的配對肺癌細胞系CL1和CL1-5研究HIF-1α的表達時發(fā)現(xiàn)，HIF-1α僅在高侵襲能力的CL1-5細胞系中表達，并且沉默HIF-1α表達后可以明顯降低其侵襲能力。深入的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以通過上調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）MMP1和MMP2的表達來促進肺癌細胞的侵襲。Li等[33]在2009年利用94例非小細胞肺癌標本進行免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1α、HIF-2α與CC趨化因子受體7（CC chemokine receptor 7,CCR7）的表達呈現(xiàn)正相關性，而深入的細胞實驗結果顯示，HIF-1α和HIF-2α可以正向調節(jié)CCR7的表達，而CCR7又可以通過促進激酶ERK的磷酸化來促進肺癌細胞的遷移。2010年Jacoby等[34]利用兩株非小細胞肺癌細胞模型和兩株小細胞肺癌細胞模型，在裸鼠中進行了實驗，發(fā)現(xiàn)用HIF-1α的拮抗劑PX-478對小鼠進行灌胃處理，可以明顯抑制原位腫瘤的生長和縱隔轉移，并與較好的預后相關。以上研究結果均表明，低氧可以通過HIF促進肺癌侵襲轉移，從而影響肺癌的預后。

4.2 PHD在肺癌中的作用 脯氨酸羥化酶PHD家族有PHD1、PHD2和PHD3三個成員，在低氧和常氧條件下發(fā)揮降低抑癌蛋白HIF的作用。2006年Davidson等[35]在肺腺癌A549細胞中發(fā)現(xiàn)，可溶性的鎳可以抑制PHD的羥化功能以及PHD與HIF的作用，從而穩(wěn)定了HIF，此項研究開創(chuàng)性地提出PHD可以作為肺癌治療的靶點。2008年Giatromanolaki等[36]利用73例非小細胞肺癌患者標本進行研究發(fā)現(xiàn)，其中的33例標本具有高HIF/PHD表達，而只有18例標本具有低的HIF/PHD表達，這一結果在臨床標本水平提示了HIF的促癌作用和PHD的抑癌作用。2001年Chen等[37]發(fā)現(xiàn)調節(jié)HIF的關鍵分子脯氨酸羥化酶PHD1、PHD2和PHD3均在62例配對非小細胞肺癌標本的癌組織中高表達。通過與臨床資料和病理結果的相關性分析，發(fā)現(xiàn)PHD3的高表達與腫瘤分期較早及分化相關，通過病理切片染色還發(fā)現(xiàn)PHD3的高表達與抗凋亡蛋白Bcl-2呈負相關。這一報道提示在非小細胞肺癌中PHD3可能具有潛在的促凋亡功能。2011年Andersen等[38]擴大了樣本量，他們利用335例I期到III期的非小細胞肺癌標本進行組織芯片和免疫組化染色實驗，檢測了三種脯氨酸羥化酶的表達情況，并分析與預后的關系。研究結果顯示PHD1、PHD2和PHD3在肺癌標本中均高表達，并且與較差的預后相關聯(lián)，具有高表達PHD的病例5年存活率明顯低于低表達組。這一結果提示脯氨酸羥化酶也可能具有促癌作用。在2012年最新的一項研究中，Chen等[39]應用原位雜交技術和免疫組化染色技術，在26例肺癌標本中檢測了HIF及三種脯氨酸羥化酶的表達情況，其中12例病例伴有慢性阻塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease, COPD），而其余14例為對照組。通過醫(yī)學統(tǒng)計學分析得出結論，脯氨酸羥化酶通過調節(jié)HIF，在肺癌病例中參與了COPD的低氧肺血管重建過程。

4.3 pVHL在肺癌中的作用 雖然pVHL被證明可以通過泛素化降解途徑下調促癌蛋白HIF而發(fā)揮抑癌基因的功能。但是，肺癌方面功能的報道中卻顯示pVHL存在兩方面作用。1997年Corless等[40]率先通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，pVHL主要在肺癌細胞的細胞質有較強的表達。2001年Kamada等[41]發(fā)現(xiàn)肺癌H1299細胞中導入外源表達的pVHL，可以穩(wěn)定肌動蛋白組織裝配，并通過促進黏著斑形成，抑制肺癌細胞的遷移能力，這是首次發(fā)現(xiàn)pVHL在肺癌細胞中具有抑癌作用。而最新的研究報道顯示了pVHL的促癌作用。Zhou等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細胞A549中穩(wěn)定沉默pVHL表達可以明顯降低細胞的成克隆能力和增殖能力，揭示了pVHL同樣可以發(fā)揮促癌作用，并且暗示了非HIF依賴的pVHL新功能。

5 結語

從腫瘤低氧微環(huán)境最初被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在的60年中，人們已經清楚地了解了它的存在、調節(jié)機制和意義及功能。越來越多的研究表明，低氧對各種類型的腫瘤包括肺癌均起到十分重要的作用。低氧誘導因子HIF也已成為肺癌發(fā)生發(fā)展過程中一個極其重要的調控因子。HIF在肺癌中的高表達與增殖和預后等相關聯(lián)，使其可以作為肺癌發(fā)生發(fā)展和預后的分子標記存在。此外，調節(jié)HIF的重要分子PHD和pVHL也在肺癌組織細胞中主要呈現(xiàn)低表達，并發(fā)揮重要的功能。這使得低氧、低氧誘導因子以及其調節(jié)分子PHD和pVHL成為十分有潛力的肺癌治療靶點。