孫淑芳，王媛媛，劉陸世，姜 雯，彭 程，孫映雪

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

冠狀病毒（Coronavirus）最早于1937年從雞身上分離出來(lái)，1965年，Tyrrell等人從普通感冒病人鼻洗液中分離出一株病毒，命名為B814 病毒；Hamer 等用人胚腎細(xì)胞分離到類(lèi)似病毒，代表株命名為229E 病毒。1967年，Mclntosh等用人胚氣管培養(yǎng)從感冒病人中分離到一批病毒，其代表株是OC43株。Almeida 等對(duì)這些病毒進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名這類(lèi)病毒為冠狀病毒[1]。1975 年，國(guó)際病毒命名和分類(lèi)委員會(huì)正式命名了冠狀病毒科（ Coronaviridae）。2002-2003年期間，自我國(guó)局部地區(qū)發(fā)生的非典型肺炎，即由冠狀病毒屬的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒（SARS-CoV）引起，世界上有30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼報(bào)道出現(xiàn)病例，病死率超過(guò)10%。2012年12月，中東地區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)新型冠狀病毒，到2013年6月5日，已發(fā)現(xiàn)54例確診病例，病死率超過(guò)50%，引起了世界范圍的廣泛關(guān)注，造成社會(huì)對(duì)冠狀病毒的恐慌。因此，對(duì)冠狀病毒進(jìn)行綜合分析研究具有重要意義。

1 分類(lèi)

冠狀病毒屬于單股正鏈RNA病毒，冠狀病毒科冠狀病毒屬，根據(jù)病毒的抗原性，大部分研究文獻(xiàn)將已知并已定型的冠狀病毒分為3群[1，3，12]，其中第1 群和第2 群為哺乳動(dòng)物病毒，第3 群為禽類(lèi)病毒。第1 群包括人冠狀病毒229E（HCoV-229E） 、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV） 、犬冠狀病毒（ CCoV）和貓傳染性支氣管炎病毒（ FCoV） ；第2群包括人冠狀病毒OC43（ HCoV-OC43） 、牛冠狀病毒（BCoV） 、火雞冠狀病毒（TCoV） 、鼠肝炎病毒（MHV）、豬血凝性腦脊髓炎病毒（ HEV） 和大鼠冠狀病毒（ RtCoV） ；第3 群包括禽傳染性支氣管炎病毒（ IBV） 和火雞藍(lán)冠病病毒（ TCoV）[3]。非典型肺炎SARS-CoV 病毒基因組與已有的冠狀病毒的基因序列同源性都不高，所以被認(rèn)為是第4 群冠狀病毒[2，4，11]。

2 形態(tài)結(jié)構(gòu)

冠狀病毒為多形態(tài)，略呈球形，直徑80-160nm。有囊膜，表面覆有長(zhǎng)12-24nm的纖突，纖突末端呈球狀，規(guī)則地在囊膜表面排列成皇冠狀，故得名冠狀病毒。病毒粒子囊膜由雙層脂質(zhì)組成，在脂質(zhì)雙層中穿插有兩種蛋白：膜蛋白（M）和纖突蛋白（S）。部分冠狀病毒，如BCoV、HEV、HCoVOC43和TCoV的囊膜上還有第三種蛋白，即血凝素糖蛋白（HE）。病毒粒子內(nèi)部由RNA和核衣殼蛋白（N）組成，呈螺旋式結(jié)構(gòu)，直徑9-16nm。

3 基因組結(jié)構(gòu)

冠狀病毒的基因組為單鏈正股RNA，大小為27～32 kb，是目前已知RNA 病毒中最長(zhǎng)的。具有mRNA 的功能和感染性，導(dǎo)入真核細(xì)胞后能引起感染。基因組包含6～12 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF） ，5′末端有帽結(jié)構(gòu)， 3′末端有PolyA 尾。基因組含有約7～10 個(gè)功能基因，其中4～5 個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，在所有的冠狀病毒基因組中，聚合酶基因（ Pol） 和3種結(jié)構(gòu)蛋白基因的排列次序均相同，即5'-pol-S-M-N-3'，其他編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和HE 的基因在基因數(shù)目、核苷酸序列和基因排列次序上往往依不同的冠狀病毒而有較大的差異。非結(jié)構(gòu)蛋白基因散布于結(jié)構(gòu)蛋白基因之間。

4 主要結(jié)構(gòu)蛋白

4.1 纖突蛋白（S）

S蛋白是伸出囊膜20 nm 的球-桿形的病毒融合性糖蛋白，分子量約150～180 kDa。由1 400～1 800 個(gè)氨基酸組成的，每個(gè)冠狀病毒大約有200 個(gè)S 蛋白，以二聚體或三聚體的形式存在，S 蛋白是冠狀病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，攜帶主要的B 淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是惟一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白；含有宿主細(xì)胞受體識(shí)別位點(diǎn)，在決定宿主細(xì)胞親嗜性方面起關(guān)鍵作用；決定病毒的致病性；具有細(xì)胞膜融合作用，使病毒核蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[5-6，11]，總之，S蛋白決定病毒感染的種屬特異性和組織親嗜性，是病毒毒力的主要決定部分。

4.2 膜蛋白（ M）

M 蛋白是病毒跨膜蛋白，分子量20～30 kD ，大部分位于囊膜內(nèi)，僅有氨基端糖基化的小部分暴露在囊膜外面。M 蛋白是負(fù)責(zé)病毒顆粒組裝的主要蛋白質(zhì)，與病毒囊膜形成與出芽有關(guān)。M 蛋白同N 蛋白的C 端結(jié)合，介導(dǎo)核衣殼裝配入病毒體。

4.3 核衣殼 蛋白（N）

N 蛋白是核蛋白，分子量為50～60kD ，N 蛋白能與病毒RNA 緊密結(jié)合，通過(guò)螺旋堆積將RNA 封裝，從而保護(hù)病毒的基因組RNA， IBV 和MHV N 蛋白都可以同核仁中的核仁纖維蛋白和核仁素相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)延遲，使細(xì)胞更長(zhǎng)時(shí)間的停留在分裂間期，此時(shí)病毒RNA 可以最大程度的翻譯[13]。

4.4 血凝素酯酶糖蛋白（ HE ）

第二群冠狀病毒，如BCV、HEV、HCV、OC43和MHV - DVIM 等存在，分子量120～140 kD ，目前認(rèn)為HE蛋白可能與病毒吸附有關(guān)，能引起紅細(xì)胞凝集，且是有乙酰酯酶活性，HE蛋白目前研究的不多，但其對(duì)病毒粒子的形成起著相當(dāng)重要的作用[8]。其氨基酸序列與丙型流感病毒的HE 蛋白同源，推測(cè)是基因組同丙型流感病毒重組而獲得的[7，12]。

5 分離與鑒定

冠狀病毒能在多種細(xì)胞上增殖，各種冠狀病毒適應(yīng)細(xì)胞種類(lèi)如下：雞傳染性支氣管炎病毒適應(yīng)雞胚、幼雞氣管環(huán)器官培養(yǎng)、原代雛雞腎細(xì)胞；犬冠狀病毒適應(yīng)原代犬腎細(xì)胞；貓冠狀病毒適應(yīng)原代幼貓腹膜細(xì)胞；豬傳染性胃腸炎病毒和豬血凝性腦脊髓炎病毒適應(yīng)原代豬腎細(xì)胞、脾細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞和睪丸細(xì)胞；豬流行性腹瀉病毒適應(yīng)胎豬腸細(xì)胞；犢牛腹瀉病毒適應(yīng)恒河猴腎細(xì)胞、胎牛腎細(xì)胞；小鼠肝炎病毒適應(yīng)鼠巨噬細(xì)胞、鼠DBT細(xì)胞、鼠17CL-1細(xì)胞、人冠狀病毒適應(yīng)繼代人胚腎細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、有胚氣管環(huán)器官培養(yǎng)、L132細(xì)胞、人胚肺細(xì)胞。

鑒定病毒的最常用方法是病毒中和實(shí)驗(yàn)，用已知的特異性抗血清對(duì)分離病毒進(jìn)行中和后，在細(xì)胞或組織培養(yǎng)物上進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)是否出現(xiàn)病變判定是否有中和反應(yīng)從而對(duì)病毒做出鑒定?，F(xiàn)在較常用分子基因技術(shù)，比病毒分離及中和方法可更快速、靈敏，并且準(zhǔn)確做出診斷鑒定，例如，采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)直接對(duì)病料樣品、試子或病毒培養(yǎng)物進(jìn)行病毒特異基因片段擴(kuò)增，再進(jìn)行序列測(cè)定比對(duì)，從而鑒定病毒。

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、血凝試驗(yàn)和間接血凝實(shí)驗(yàn)等，通過(guò)檢測(cè)抗體的有無(wú)以確定是否有病毒感染。

在病毒的不同感染期應(yīng)采取不同的檢測(cè)方法，例如，有報(bào)道指出[3]，在SARS病毒感染后出現(xiàn)發(fā)燒癥狀的前10 天內(nèi)使用RT - PCR 技術(shù)便可檢測(cè)病人是否感染病毒，但在發(fā)病后期使用RT - PCR 技術(shù)往往會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，此時(shí)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確。

6 冠狀病毒感染

冠狀病毒的宿主范圍與病毒特異的細(xì)胞受體直接相關(guān)，病毒粒子經(jīng)受體介導(dǎo)吸附于敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜上，通過(guò)HE 或S 蛋白結(jié)合于細(xì)胞膜上的糖蛋白受體，吸附在敏感細(xì)胞膜上的病毒粒子通過(guò)膜融合或胞吞作用侵入細(xì)胞。病毒經(jīng)口、鼻感染后，對(duì)淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)殺細(xì)胞作用，從而損害多種器官。冠狀病毒急性感染后，還可能發(fā)生持續(xù)性感染，病毒在細(xì)胞與細(xì)胞之間慢性傳播，引起細(xì)胞死亡和器官病理變化。這種現(xiàn)象已在小鼠肝炎病等得到證實(shí)。其他冠狀病毒，如雞傳染性支氣管炎病毒、人冠狀病毒也可能發(fā)生持續(xù)性感染。

就目前所知，冠狀病毒只感染脊椎動(dòng)物，具有胃腸道、呼吸道和神經(jīng)系統(tǒng)嗜性，分別引起相應(yīng)癥候群。人冠狀病毒是引起人類(lèi)普通感冒和咽炎的病毒之一，感染患者都表現(xiàn)急性上呼吸道感染癥狀，如鼻炎、鼻塞、噴嚏和咽炎等；嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥SARS病毒和中東新型冠狀病毒則在肺部引起嚴(yán)重癥狀；雖然冠狀病毒本身有許多獨(dú)特之處，但其所引起的臨床癥狀，則與由鼻病毒引起的普通感冒或由流感病毒引起的流行性感冒極其相似。冠狀病毒亦引起許多動(dòng)物的疾病，如：雞傳染性支氣管炎、豬傳染性胃腸炎病、犬冠狀病毒病、貓腸道冠狀病毒病、貓傳染性腹膜炎病、兔冠狀病毒病、小鼠肝炎病、大鼠誕淚腺炎病、豬凝血性腦脊髓炎病、牛冠狀病毒病、兔腸道冠狀病毒病和火雞蘭冠病等。

7 冠狀病毒防治

冠狀病毒沒(méi)有特效的藥物治療方法，采用針對(duì)病毒的特異性抗體可有效治療。一些抑制劑和蛋白酶制劑，能夠減輕或阻斷自身免疫損傷。免疫預(yù)防和消毒是防治冠狀病毒感染傳播的有效手段。冠狀病毒與流感等呼吸系統(tǒng)感染病毒的傳播途徑相似，經(jīng)口液、噴嚏、接觸傳染，并通過(guò)空氣飛沫傳播，感染高峰在秋冬和早春。病毒對(duì)熱敏感，紫外線、來(lái)蘇水、過(guò)氧乙酸及等都可在短時(shí)間內(nèi)將病毒殺死。大部分冠狀病毒應(yīng)用1%的煤酚、1/10000高錳酸鉀、70%酒精和1%福爾馬林均可在室溫條件下幾分鐘內(nèi)殺死。

目前疫苗可分為四類(lèi)，即滅活疫苗、弱毒活疫苗、DNA 疫苗和基因工程疫苗。由于冠狀病的高變異特點(diǎn)，直接采用流行株或已證明能夠完全保護(hù)流行株的致弱毒株制備的滅活疫苗免疫效果最好，但疫苗的制備過(guò)程可能存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)際免疫中，應(yīng)注意根據(jù)毒株流行情況選用合適的疫苗。

8 冠狀病毒病示例

8.1 雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）

傳染性支氣管炎病毒（IBV）能引起雞急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病，可造成養(yǎng)雞業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。病死率高達(dá)30%，該病在幾乎世界范圍內(nèi)所有的養(yǎng)雞國(guó)家存在，并呈地方流行。IBV 基因具有冠狀病毒基因組的一般結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，無(wú)HE結(jié)構(gòu)蛋白基因，該病毒在不同地域及進(jìn)化過(guò)程中易發(fā)生分化，形成不同的血清型，自1931年發(fā)現(xiàn)該病原以來(lái)，至少有29種低交叉性血清型被報(bào)道，而且新的血清型和變異株仍在不斷出現(xiàn)，各血清型之間沒(méi)有或僅有部分的交互免疫作用，各從而使得該病毒免疫較為困難，免疫時(shí)應(yīng)根據(jù)地方流行病毒株血清型選用合適的疫苗。診斷技術(shù)方面，我國(guó)一些專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室已建立IBV分離技術(shù)及針對(duì)基因組保守區(qū)域的RT-PCR鑒定方法，近年來(lái)，Real-time RT-PCR也用于IBV的診斷，但主要局限于實(shí)驗(yàn)室對(duì)病毒的定量以及臨床組織樣本中病毒的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室常用的血清學(xué)檢查主要應(yīng)用間接ELISA、免疫熒光技術(shù)（IFA）、血凝和血凝抑制試驗(yàn)（IBV本身沒(méi)有血凝性，但經(jīng)一定處理后會(huì)產(chǎn)生血凝性）；但I(xiàn)BV商品化檢測(cè)試劑在我國(guó)仍然是IBV研究的難點(diǎn)之一。

8.2 豬傳染性胃腸炎（TGEV ）

是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是豬的一種高度接觸性傳染病。TGEV屬冠狀病毒屬第2抗原群病毒，疫病臨床特征為豬的嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水，不同年齡和品種的豬都易感，但2周以?xún)?nèi)仔豬感染死亡率很高。5周齡以上的豬感染很少死亡。該病1933年被初次發(fā)現(xiàn)，目前除阿拉斯加和北歐各國(guó)外，在北半球，特別是北緯30°以北的溫帶至寒帶地區(qū)，均有本病分布。目前的研究表明，TGEV只有一個(gè)血清型，各毒株之間有密切的抗原關(guān)系，疫苗免疫可采用細(xì)胞培養(yǎng)強(qiáng)毒和弱毒滅活疫苗，免疫效果良好。我國(guó)的一些專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室已建立了檢測(cè)TGEV的RTPCR、熒光RT-PCR方法，及抗體檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。

8.3 人冠狀病毒

目前已知的能感染人的冠狀病毒共6種，分別為20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒HCoV-229E和HCoV—OC43，2003年新出現(xiàn)的SARS冠狀病毒SARS-CoV，2004年發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒HCoVNL63，2005年新發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒HCoV—HKU1及2012年7月在中東地區(qū)出現(xiàn)的新型人冠狀病毒HCoV-EMC。

8.3.1 嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒（SARS-CoV）

是我國(guó)非典型性肺炎SARS的病原體，感染者以發(fā)熱、肺部感染為主要特征。目前病毒已在人群中消失。SARS-CoV 基因組屬于典型的冠狀病毒基因型，具有冠狀病毒的一般特點(diǎn)。但SARS-CoV 不是任何一種已知冠狀病毒的突變體，也不是已知冠狀病毒的重組體。SARS-CoV的直接宿主至今仍沒(méi)有明確答案。但是，在SARS-CoV的溯源過(guò)程中，科學(xué)家們從多種蝙蝠類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)分離到多種冠狀病毒。其中，從菊頭蝠屬蝙蝠體內(nèi)分離到的冠狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征與SARS-CoV相似，而且核苷酸的一致性很高，在88%～92%之間，故將該類(lèi)冠狀病毒稱(chēng)為SARS樣冠狀病毒（SARS-like-CoV）。

SARS-CoV的檢測(cè)方法很多。分子生物學(xué)技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（ RT-PCR）和熒光定量RTPCR 技術(shù)；病毒培養(yǎng)技術(shù)是利用非洲猴腎傳代細(xì)胞（VERO E6）來(lái)培養(yǎng)SARS患者血液、糞便和呼吸道分泌物標(biāo)本中的病毒，該方法是唯一能證明活病毒存在的方法；血清學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）以及電鏡技術(shù)和病毒全基因組芯片檢測(cè)，以上檢測(cè)方法各有利弊，WHO建議用于檢驗(yàn)SARS患者標(biāo)本的收集和儲(chǔ)存應(yīng)是連續(xù)的，這樣可以使診斷性檢測(cè)變得直接有效。SARS冠狀病毒可以在細(xì)胞培養(yǎng)中高滴度生長(zhǎng)。SARS 冠狀病毒活疫苗已經(jīng)生產(chǎn)，SARS 疫苗預(yù)防性接種可能保護(hù)醫(yī)護(hù)工作者和在病毒流行區(qū)的高危人群。

8.3.2 新型人冠狀病毒（HCoV-EMC）

新型冠狀病毒感染者會(huì)出現(xiàn)急性、嚴(yán)重呼吸道疾病，伴有發(fā)熱、咳嗽、氣短及呼吸困難，部分病例出現(xiàn)腎功能衰竭和死亡。從系統(tǒng)發(fā)生上分析，該病毒與bat-CoVHKU4和bat-CoVHKU5的親緣關(guān)系比較接近，基因組相似性都為70.1%，而與SARS病毒基因組相似性為54.9%[10]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒能夠感染人類(lèi)和蝙蝠的細(xì)胞，能夠感染多種蝙蝠和豬，使動(dòng)物可成為持續(xù)感染源，病毒有可能在多個(gè)物種之間傳播。診斷技術(shù)方面，目前已有成熟的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，ABI公司推出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR芯片系統(tǒng)。

目前新型冠狀病毒的宿主、感染源、人體感染途徑等問(wèn)題都未徹底了解清楚。在長(zhǎng)時(shí)間近距離接觸的情況下，這種病毒很可能通過(guò)空氣和唾液傳播。但從疫情持續(xù)時(shí)間和病例總數(shù)來(lái)看，新型冠狀病毒的傳播能力遠(yuǎn)不及SARS。這種新型冠狀病毒目前尚無(wú)特異性治療措施，也沒(méi)有預(yù)防這種病毒的疫苗和特效療法。有效預(yù)防措施是通風(fēng)、消毒、遠(yuǎn)離高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域和人群，并及早診斷和治療，由醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)患者進(jìn)行對(duì)癥治療，并借助體外循環(huán)技術(shù)，對(duì)呼吸功能不全的重癥患者給予輔助性呼吸循環(huán)治療。

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