韋恩·亨特

蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)基（西方蜜蜂膜翅目蜜蜂科）

韋恩·亨特

媒介在膜翅目昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的研究已趨成熟，如蜜蜂（膜翅目蜜蜂科）。用蜜蜂幼體或蛹作為初始材料，并用改進(jìn)的Hert-Hunter 70培養(yǎng)基已經(jīng)培育出多種蜜蜂細(xì)胞。蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)體系可以解決阻礙屏蔽分離群落中病原菌的困境，而這些病原菌可能會(huì)引起蜂群混亂、大批死亡。從蜜蜂的幼體到早期蛹的多個(gè)生命階段，從頭部、胸部、腹部的組織均已成功建立細(xì)胞培養(yǎng)。懸浮，貼壁以及類似上皮單層細(xì)胞等多種類型的蜜蜂細(xì)胞已經(jīng)培養(yǎng)出來了。WH2剛開始是為培養(yǎng)半翅目昆蟲，如亞洲柑桔木虱、葉蟬、Homalodisca vitripennis細(xì)胞培養(yǎng)，后來發(fā)現(xiàn)它同樣適用于其他很多不同種昆蟲，比如蜜蜂。蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)隨溫度在21～23℃變化下增加9～15天的時(shí)間。在初期離體培養(yǎng)組織中檢測(cè)到蜜蜂殘翅畸形病毒，用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)出以色列急性麻痹病毒（IAPV），但是沒有檢測(cè)到克什米爾病毒（蜜蜂急性麻痹病毒）和黑蜂王臺(tái)病毒。用IAPV接種佛羅里達(dá)地區(qū)的蜜蜂樣本，在經(jīng)歷兩次傳代培養(yǎng)后仍能檢測(cè)到IAPV病毒。膜翅目昆蟲如蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)的研究大大促進(jìn)了蜂群崩潰失調(diào)病的研究可行性。

蜜蜂；蜂群崩潰失調(diào)癥（CCD）；膜翅目；葉蟬；木虱；病毒

CCD對(duì)于授粉蜜蜂是個(gè)嚴(yán)峻的問題。CCD研究的瓶頸之一就是缺少蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)體系提供了快速評(píng)估病原菌感染作用及其在蜜蜂細(xì)胞生長(zhǎng)與生存的影響。很多行業(yè)靠生產(chǎn)，利用活的昆蟲作為兩棲和爬行寵物的食物，利用寄生物做生物防控，比如利用蜜蜂授粉獲得食物和農(nóng)作物的增產(chǎn)。然而，蜜蜂或其他膜翅目授粉昆蟲中CCD現(xiàn)象引起巨大關(guān)注，因?yàn)轲B(yǎng)蜂業(yè)的存亡可是與國(guó)民食品安全緊緊相連的。寄生于害蟲的病毒性病原菌，不僅可以殺死害蟲還能傳播到其他昆蟲體內(nèi)。出于在人工條件下的研究和商業(yè)目的，在其他昆蟲群落里也已有過CCD研究。典型的病毒性感染癥狀包括強(qiáng)勢(shì)群落的前蛹期羽化為成年，然而，它們大多數(shù)剛發(fā)育為成年蜂的都不能存活。在運(yùn)用環(huán)境基因?qū)W方法的深入研究下，發(fā)現(xiàn)了一種蜜蜂感染病毒，以色列急性麻痹病毒（IAPV）。據(jù)目前報(bào)道，蜜蜂易受17種不同的病毒侵害。它們也易受數(shù)種小孢子蟲侵害，其中小孢子屬尤其受關(guān)注。然而，蜜蜂病原菌因缺少細(xì)胞系而很難被找出，蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)恰好給研究者們提供了針對(duì)蜜蜂病毒和真菌類感染在CCD中的作用這樣一些非常棘手的難題的解決方法。蜜蜂細(xì)胞體系的進(jìn)一步應(yīng)用可以解決受阻困境，更好地闡明病原菌對(duì)蜜蜂CCD的影響和作用。

1.蜜蜂幼蟲和蛹的細(xì)胞

利用當(dāng)?shù)厣a(chǎn)商提供的一個(gè)封蓋的育王框巢脾，用尖頭醫(yī)用鑷子將未封蓋的幼蟲和封蓋巢房里的蛹小心取出。這些白色幼蟲都帶有剛剛長(zhǎng)出的頭。初期階段的蛹，眼睛白色，完全發(fā)育并具有棕褐色眼睛的頭部，他們選擇了那些眼睛為深褐色的蛹。在消毒過的,層流凈化罩中,用70%乙醇對(duì)蜜蜂體表消毒，輕輕震蕩10分鐘。每2分鐘用0.22 μm膜過濾的水進(jìn)行清洗。用無菌鑷子分開其頭部，胸部，腹部。在室內(nèi)溫度為22℃下，蜜蜂組織在WH2培養(yǎng)基中切分并分至24孔板，每個(gè)孔內(nèi)少放組織為宜，腹部組織被分散至四個(gè)分開的平板。一般在4～10天時(shí)間，細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)生長(zhǎng)，接下來每隔7～12天更換一下1/3的培養(yǎng)基。懸浮的細(xì)胞和殘骸被轉(zhuǎn)移至25 cm2的組織培養(yǎng)瓶中，觀察新細(xì)胞48小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)情況。

2.培養(yǎng)基和添加劑

蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)基WH2的組成是由木虱細(xì)胞培養(yǎng)基HH-70稍作修改而成。昆蟲培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基199。在WH2培養(yǎng)基中24小時(shí)內(nèi)可以看到接種的組織貼壁生長(zhǎng)，L-谷氨酸的添加與否不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此實(shí)驗(yàn)最后沒添加L-谷氨酸。L-glutamine WH2培養(yǎng)基的成份見表1。慶大霉素被用作抗生素。針對(duì)含有個(gè)別培養(yǎng)基配置而成的商業(yè)化的可用培養(yǎng)基的篩選，每隔8天對(duì)細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。加有10%胎牛血清的培養(yǎng)基之后，分別檢測(cè)蜜蜂細(xì)胞在HH-70木虱細(xì)胞培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況，再觀測(cè)和在Sf-900TMIII SFM中無10%胎牛血清的培養(yǎng)基的蜜蜂細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)顯示，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，呈半透明，通常觀察到的是以單個(gè)細(xì)胞形式存在。細(xì)胞在Ex-Cell 405能存活，但細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)速率極慢，處于一個(gè)非常低的頻率。將HH-70中其他的成分作為細(xì)胞培養(yǎng)基，蜜蜂細(xì)胞可以存活，但沒有貼壁生長(zhǎng)。

3 .細(xì)胞系檢測(cè)

通過PCR，利用蜜蜂特異性引物與肌動(dòng)蛋白進(jìn)行分析。從細(xì)胞培養(yǎng)和成年蜂中提取其染色體DNA，提取方法：AquaPureRGenomic DNA Kits(BIO-RAD,Hercules,CA)。PCR試驗(yàn)是用PlatinumRPCR Super-MixTM，反應(yīng)條件是：95℃，3分鐘；95°C，30秒，60℃，30秒；72℃，30秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃下維持5分鐘，從而得到提取物。葉蟬基因作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)和成年蜂中的肌動(dòng)蛋白基因中擴(kuò)增引物的大小和序列是相同的，但與木虱中的不同。

與Maori等.2009年的報(bào)道相類似，在培養(yǎng)體中，發(fā)現(xiàn)只有殘翅病毒被檢測(cè)到。接種過IAPV的細(xì)胞在數(shù)次繼代培養(yǎng)后檢測(cè)仍呈陽性。在WH2培養(yǎng)基中培養(yǎng)蜜蜂幼蟲和蛹的細(xì)胞，24小時(shí)就能觀察到細(xì)胞貼壁蔓延生長(zhǎng)。單層細(xì)胞是由類似葉蟬的兩種上皮細(xì)胞組成。細(xì)胞培養(yǎng)基都貼上“AmWH”標(biāo)簽。這種梭狀的細(xì)胞，1～2 μm寬，2.5～10 μm長(zhǎng)，形成細(xì)胞簇。懸浮培養(yǎng)出的是圓形細(xì)胞，直徑為1～2 μm。盡管以前培養(yǎng)基評(píng)估中有2 mM L-谷氨酸，然而此評(píng)估顯示L-谷氨酸的有無對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有影響，但是來自草地夜蛾的鱗翅類細(xì)胞系在谷氨酸鹽缺乏的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。

如今，擁有可以提供蜜蜂細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，為研究者提供了極需的研究工具，而它將在圍繞引起膜翅目授粉昆蟲的CCD原因和針對(duì)CCD獲得可行性的解決辦法具有重要意義。蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)同樣提供了一個(gè)在蜜蜂繁殖中病毒感染的高度防控體系，對(duì)其在蜜蜂病毒病理學(xué)上的進(jìn)一步研究具有重要意義。

注：蜜蜂細(xì)胞培養(yǎng)基WH2成分

Schneider's Insect Medium 150 ml

0.06 ML-histidine solution(pH 6.35)200 ml

Fetal Bovine Serum(heat inactivated)a 50 ml

CMRL 1066 15 ml

Hanks'Salts 5 ml

Insect medium supplement(×10)2 ml

Gentamicin,units/1 μl/ml

培養(yǎng)基總?cè)萘?22 ml；用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH在6.3～6.5范圍中

56°C胎牛血清熱處理30分鐘

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所 汪天澍 余林生譯