匡先鉅，錢明惠，黃煥華，黃詠槐，范軍祥，沈木勝

(廣東省林業(yè)科學(xué)院，廣東廣州 510520)

墨天牛屬Monochamus Geyer屬鞘翅目Coleoptera多食亞目Polyphaga葉甲總科Chrysomeloidea天?？?Cerambycidae 溝脛天牛亞科 Lamiinea［1］。由于多種墨天牛是松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus的媒介昆蟲，松墨天牛Monochamus alternatus和樟子松墨天牛M．galloprovincialis Olivier等墨天牛屬昆蟲已成為多個國際植物保護和檢疫組織的重要檢疫對象［2］。

目前，國內(nèi)外對墨天牛生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性，發(fā)生規(guī)律以及防治方法進行了比較深入的研究。隨著研究的深入，人們逐步認識到調(diào)節(jié)昆蟲行為活動的信息化學(xué)物質(zhì)在害蟲治理中的應(yīng)用潛力和廣闊前景，墨天牛性信息素和性引誘劑的研發(fā)越來越受到關(guān)注。作者綜述了墨天牛屬性信息素研究進展以及研究方法，以期為研發(fā)我國松材線蟲病的主要媒介昆蟲松墨天牛引誘劑提供依據(jù)，同時為其它昆蟲性信息素的研究提供參考。

1 墨天牛性信息素研究進展

天牛存在性引誘現(xiàn)象最早是Linsley于1959年報道的，他發(fā)現(xiàn)馬來西亞花天牛亞科某些種類受限制的雌成蟲能引誘飛翔中的雄成蟲。但直到20世紀70年代，人們才發(fā)現(xiàn)了天牛性信息素的存在。

1.1 天牛性信息素的種類 昆蟲性信息素屬于種內(nèi)信息素，是由同種昆蟲的某一性別個體的特殊分泌器官分泌于體外，能被同種異性個體的嗅感器接受，并引起異性個體產(chǎn)生一定行為反應(yīng)或生理效應(yīng)(如覓偶、定向求偶、交配等)的微量化學(xué)物質(zhì)［3-4］。從性信息素作用范圍的角度，天牛性信息素可分為長距離性信息素(long range sex pheromone)、短距離性信息素(short range sex pheromone)和通過雌雄成蟲接觸才能導(dǎo)致性識別的接觸性信息素(contact sex pheromone)［5］。

1.2 樟子松墨天牛性信息素的研究進展 松材線蟲病的歐洲媒介昆蟲樟子松墨天牛的性信息素研究已經(jīng)取得突破性進展。Ibeas等通過觀察樟子松墨天牛交配行為發(fā)現(xiàn)雄蟲緊緊抱住雌蟲后，用下顎須和下唇須舔舐其鞘翅后才交配。推測樟子松墨天牛雌蟲體表存在接觸性信息素;樟子松墨天牛“Y”型嗅覺儀性引誘的性行為學(xué)結(jié)果顯示達到性成熟的雄蟲能釋放短距離性信息素［6］。Ibeas等用固相微萃取法SPME和溶劑萃取(solvent extraction)2種方法分析了樟子松墨天牛的性信息素，發(fā)現(xiàn)雌雄蟲表皮成分種類差異不大，只存在比例的差別［7］。Pajares等通過氣質(zhì)聯(lián)機對觸角電位反應(yīng)相對應(yīng)保留時間的氣相色譜化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，首次鑒定出1種由雄性產(chǎn)生的性信息素，2-十一烷氧基-1-乙醇(2-undecyloxy-1-ethanol)，進一步生物測定實驗證明此化合物對成熟雌蟲有明顯的吸引作用，可作為誘殺樟子松墨天牛的性引誘劑［8］。

1.3 松墨天牛性信息素研究進展 關(guān)于松墨天牛性信息素，不同學(xué)者的研究結(jié)果并不一致。Okamoto認為松墨天牛兩性個體可被植物的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)吸引而聚集到寄主植物上，雄蟲通過觸角觸探雌蟲體表接觸性信息素而識別異性個體［9］。Hanks野外觀察顯示，松墨天牛雌、雄成蟲通過寄主引誘聚集后，存在雄蟲觸角接觸雌蟲來完成擇偶的行為［10］，暗示觸覺感受在擇偶過程中有較重要作用。樊建庭等推測松墨天牛不存在雌性接觸性信息素，主要是通過視覺找到配偶，完成交配過程［11］。一些學(xué)者則認為松墨天牛產(chǎn)生長距離信息素，如Fauziah等通過室內(nèi)和林間試驗，提出松墨天牛雄蟲釋放長距離信息素吸引雌蟲，近距離時通過觸角識別雌蟲體表的接觸性信息素進而產(chǎn)生一系列性行為［12］;Kim等認為，松墨天牛交配行為分為2個階段:1)雌蟲受雄蟲揮發(fā)性信息素的吸引;2)雄蟲用觸角感受雌蟲體表的接觸性信息素后發(fā)生交配行為［13］。Teale等用樟子松墨天牛的性信息素2-十一烷氧基-1-乙醇在福建林間誘捕到了松墨天牛的雌蟲和雄蟲，進一步研究證明松墨天牛雄蟲也能產(chǎn)生2-十一烷氧基 -1-乙醇，而雌蟲則不能［14］。

2 墨天牛性信息素的研究方法

墨天牛性信息素的研究步驟為:1)性行為學(xué)觀察和引誘實驗推測天牛是否存在性信息素及其類型;2)利用吸附法或萃取法提取天牛身上的氣味物質(zhì);3)通過氣相色譜與觸角電位聯(lián)用(GC-EAD)技術(shù)確定松墨天牛觸角有反應(yīng)的保留時間，用氣質(zhì)聯(lián)機對觸角電位反應(yīng)相對應(yīng)保留時間的氣相色譜化合物進行分子結(jié)構(gòu)鑒定;4)如果鑒定結(jié)果為已知商品化的化合物，則用標樣化合物對鑒定結(jié)果做進一步確認;如果鑒定結(jié)果為未商品化的化合物，則合成該化合物，用合成的化合物標樣對氣質(zhì)聯(lián)機鑒定結(jié)果做進一步確認;5)采用風洞實驗或田間實驗方法用松墨天牛成蟲對性信息素進行生物測定。

2.1 墨天牛性信息素種類的確定

2.1.1 接觸性信息素測定 為了測試樟子松墨天牛交配識別中雌蟲是否存在接觸性信息素，Ibeas等［7］參考其它天牛種類確定接觸性信息素的方法設(shè)計了以下實驗:1)將1頭樟子松墨天牛雌蟲置于-40℃冷凍致死，再置于室溫1 h恢復(fù)溫度，然后在旁邊放1頭雄蟲。如果雄蟲用唇或上顎吻雌蟲的背板后，彎曲身體試圖與其交配，則記錄1次正反應(yīng)。如果雄蟲用唇接觸雌蟲后沒有想要與其交配，則記錄1次負反應(yīng)。2)利用正己烷萃取同一頭雌蟲。萃取液保存在-40℃待用。被正己烷清洗過的雌蟲風干后放在相同的雄蟲前，雄蟲對正己烷清洗過的雌蟲不再有反應(yīng)。3)滴加0.1雌蟲當量(female equivalents)的濃縮萃取物(200 μL)到相同的雌蟲的背板上，風干后將該雌蟲放到同一頭雄蟲面前，如果雄蟲沒有反應(yīng)，繼續(xù)滴加0.1雌蟲當量的萃取液到雌蟲背上，并重新測試，直到整頭雌蟲萃取液的量。如果雄蟲對某一濃度做出了反應(yīng)，則不再對它進行下個更高濃度的測試。在每個測試間隔利用丙酮清洗臺面并且風干。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性天牛與冷凍殺死的雌性天牛交配，而不與正己烷清洗過的雌性天牛交配;當萃取液重新滴加到雌天牛身上后，雄天牛又會與它交配。證實了雌性天牛鞘翅上存在接觸性信息素［7］。然而樊建庭等利用相似的方法發(fā)現(xiàn)松墨天牛雌蟲并不存在接觸性信息素［11］。

2.1.2 短距離性信息素測定 樟子松墨天牛短距離性信息素的測定方法如下:按觸角長度將新羽化的雌雄天牛分開，按日齡將生測管內(nèi)的天牛分為成熟(＞15日齡)和未成熟(0到3日齡)2組。利用成熟的雌雄蟲、未成熟的雌雄蟲和地中海松Pinus halepensis枝條做氣味源，成熟的雌雄蟲或未成熟的雌雄蟲作為測試天牛。在玻璃Y形嗅覺儀(直徑4 cm，主管長24 cm，臂長22 cm，兩臂夾角70°)主管口處釋放供試天牛，讓其向上爬行選擇任意含有氣味刺激的管。當測試天牛到達管臂口時，測試結(jié)束，記錄選擇結(jié)果。

結(jié)果表明，雌蟲會被雄蟲產(chǎn)生的氣味物質(zhì)引誘，但不被雌蟲產(chǎn)生的氣味物質(zhì)吸引。然而，未成熟的雄蟲不能被成熟雌蟲釋放的引誘性信息素吸引并且未成熟的雌蟲也不被成熟雄蟲吸引，證明只有成熟雄蟲才產(chǎn)生短距離性信息素［6］。

2.1.3 長距離性信息素測定 為了測試梣紅天牛Neoclytus acuminatus(F.)是否存在長距離性信息素，Lacey等［15］在植物園做了野外籠生測實驗。實驗將3個中間間隔2 m的鋁屏風籠(aluminum screen cages，60 cm ×60 cm ×20 cm)置于 20 m 外剛伐下的至少有40頭天牛成蟲的紅白臘木Fraxinus pennsylvanica的枝條的上風口。每個籠內(nèi)裝4根剛砍下來的樸樹Celtis occidentalis圓木。其中1個籠同時裝6條梣紅天牛雄蟲，第2個籠裝6條雌蟲，第3個籠只裝樸樹圓木。每小時檢查1次籠子并且記錄停留在籠子上面的梣紅天牛的數(shù)量。

實驗結(jié)果顯示同時裝有圓木和梣紅天牛雄蟲的籠子誘到了32頭天牛，裝有圓木和梣紅天牛雌蟲的籠子誘到了5頭天牛，只裝有圓木的籠子誘到了2頭天牛，3個籠所誘到的天牛數(shù)量差異極顯著。證實雄蟲產(chǎn)生了性信息素［15］。墨天牛長距離性信息素的測定可參考此方法。

2.2 性信息素的提取方法

墨天牛氣味物質(zhì)的提取有多種方法，目前用的較多的方法有正己烷溶劑萃取法、固相微萃取法、Porapak Q吸附法等。

2.2.1 溶劑萃取 將天牛放在-20℃冰凍致死后，置于室溫30～60 min。將天牛放入干凈的裝有GC-grade正己烷的玻璃小瓶(直徑2～4 cm)中洗滌2 min，每瓶1頭。利用氦氣將萃取物濃縮，并且將1～2 μL的濃縮液體注入氣相色譜中［7］。

2.2.2 固相微萃取 將1個固相微萃取fiber holder和1個100 μm的聚二甲硅氧烷外圍的濾網(wǎng)(Supelco/Sigma-Aldrich，Madrid，Spain)在氣相色譜注射器中(250℃)清洗5 min。抓住昆蟲的腿并且用固相微萃取纖維輕輕刮昆蟲的背部30 s。然后將纖維放入注射器中，再開始氣相色譜分析［7］。

2.2.3 Porapak Q吸附法 將天牛放入燒瓶中，里面的空氣通過活性碳以2 L/min的速度過濾抽出(10 cm ×2 cm;10～18目;Fisher Scientific，Loughborough，Leicestershire，UK)，揮發(fā)物被吸附在 Pasteur移液管的玻璃木塞內(nèi)(直徑4 mm)的Porapak Q上(50～80目;200 mg;Supelco，Gillingham，Dorset，UK)。收集到的揮發(fā)物用二氯甲烷(3 mL×0.5 mL)從濾網(wǎng)上洗滌下來并且直接用來分析［8］。

2.3 性信息素的分析和鑒定

2.3.1 松墨天牛嗅感器掃描 對松墨天牛的觸角感器進行掃描觀察發(fā)現(xiàn)，松墨天牛觸角上共有7種感器，即毛形感器、錐形感器、指形感器等，觸角不同節(jié)和不同亞節(jié)上嗅覺感器的種類及數(shù)量分布存在明顯差異［16］。觸角不同節(jié)和不同亞節(jié)對氣味物質(zhì)的觸角電位反應(yīng)也存在差異［17］。

2.3.2 松墨天牛觸角電位反應(yīng) 由于松墨天牛觸角較長，難以將整個觸角固定到電極上用于天牛氣味物質(zhì)的觸角電位反應(yīng)的測定，而且氣流也難以均勻刺激到整個觸角上的所有感受器。因此，在性信息素分析的實驗中，應(yīng)該截取1段天牛觸角中含性信息素感受器豐富的部位用于實驗［16］。

2.3.3 氣味物質(zhì)的氣相色譜和觸角電位GC-EAG分析 利用1個HP 6890裝置(Agilent Technologies，Stockport，Cheshire，UK)與 1 個極性 Supelco Wax 10(Supelco，Gillingham，Dorset，UK) 和 1 個非極性SPBS(Supelco)包裹的二氧化硅毛細管圓柱(長30 m，直徑 0.32 mm，膜厚 0.25 μm)配合。2個圓柱端口與1個含推入式Y(jié)管的去活化二氧化硅管融合。Y管出口一端與火焰離子探測器(FID)相連做氣相色譜(GC)分析。另一端導(dǎo)出到1個硅烷化的玻璃T管(臂長5 cm，直徑4 mm)，T管的1個柄與1個供氮裝置(200 mL/min，每供氮3 s后間隔17 s)相連。T管的第3個柄通過GC烤箱壁到昆蟲的EAG準備階段中。EAG由1個手提式由綜合電焊鉗，顯微操縱器，和1個放大器組成的裝置(INR-02;Syntech，Hilversum，The Netherlands)記錄［8］。

2.3.4 氣味物質(zhì)的氣質(zhì)聯(lián)機GC-MS分子結(jié)構(gòu)鑒定 收集的氣味在1個有Supelco Wax 10極包圍的由二氧化硅毛細管圓柱融合的流注射器和配套的HP 6850(Agilent Technologies)裝置上進行氣相色譜分析，同時也由1個HP 6890與1個HP 5973MS(Agilent Technologies)配套在EI模式進行GC-MS分析。GC保留時間與以n-alkanes的保留時間比較轉(zhuǎn)換為保留指數(shù)(RI)。組分通過質(zhì)譜與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST 05 Mass Spectral Library;Agilent Technologies)比較和進一步的質(zhì)譜與合成水平的GC保留時間比較，從而確定性信息素的分子結(jié)構(gòu)［8］。

2.4 性信息素的合成 目前市場上應(yīng)用較多的信息素是通過化學(xué)合成獲得，根據(jù)昆蟲信息素結(jié)構(gòu)特點，選擇原料易得、條件適宜、產(chǎn)率高的合成路線，合成所需目標產(chǎn)物、衍生物及其各種異構(gòu)體［3］。

樟子松墨天牛的信息素2-十一烷氧基-1-乙醇的合成步驟如下:在干燥的二甲基甲酰胺中滴加氫化鈉到乙二醇溶液中，然后在60℃加熱30 min后，冷卻到室溫，逐滴滴加1-bromoun-decane。混合物在室溫下攪拌2 h，然后在60℃放置2 h，1-bromoundecane都發(fā)生了反應(yīng)后，混合物用含20%乙醚diethylether的石油醚petroleum ether半飽合鹽水冷卻萃取2次。有機萃取物用硫酸鎂干燥并且用硅膠過濾，隨后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)，殘留物在125℃蒸餾以得到產(chǎn)物［8］。

2.5 性信息素的生物測定

一些研究指出小蠹類的性信息素齒小蠹二烯醇(ipsdienol)、齒小蠹烯醇(ipsenol)和(S)-順馬鞭草烯醇((S)-cis-Verbenol)對多種墨天牛屬天牛具有引誘作用，而且與以松樹氣味物質(zhì) α-蒎烯(α-pinene)為主要成分的植物源引誘劑混合使用在林間具有增效作用［18］。為了測定性信息素是否具有引誘天牛的效果，可以通過風洞試驗或田間試驗對性信息素進行生物測定。

2.5.1 風洞試驗生物測定 風洞試驗參考王新花等的風洞選擇實驗。風洞儀為1.5 m×0.4 m×0.4 m的有機玻璃箱，以變速電扇從左側(cè)通過紗布吹人空氣并將洞內(nèi)風速控制在0.3 m/s［19］，將引誘劑置于風洞進風口處，觀察墨天牛對引誘劑是否有選擇行為。結(jié)果表明，雙條杉天牛會被引誘劑吸引。2.5.2 田間試驗生物測定 Pajares等在地中海松林中利用不同濃度的合成性信息素2-十一烷氧基-1-乙醇測定了松墨天牛的誘捕效果，并且調(diào)查了它與利它素化合物α-蒎烯、齒小蠹烯醇和齒小蠹二烯醇等多個組合混用的誘捕情況。結(jié)果表明，含有2-十一烷氧基-1-乙醇的誘捕器都誘捕到了雌雄樟子松墨天牛，且濃度越高，誘捕量越大;這一組分同時對利它素混合物的聚集作用起到了增效作用，它們的混合物的誘蟲量比單獨使用這兩種物質(zhì)做引誘劑所誘集到天牛的總和多80% ～140%［8］，證明了2-十一烷氧基-1-乙醇對樟子松墨天牛具有很好的誘集效果。

3 討論

目前以松樹氣味物質(zhì)α-蒎烯為主要成分的寄主植物源引誘劑在國內(nèi)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，然而植物源引誘劑對產(chǎn)卵期和產(chǎn)卵后的天牛引誘作用比產(chǎn)卵前的天牛活性高，產(chǎn)卵期和產(chǎn)卵后的天牛已經(jīng)通過產(chǎn)卵前取食和產(chǎn)卵行為將松材線蟲侵入健康松樹體內(nèi)，傳播了松材線蟲?。?7］。利用性信息素誘殺害蟲有針對性強、效果高、對天敵無害、對環(huán)境無污染等優(yōu)點［20］。如能利用松墨天牛性信息素，或者將信息素與植物源引誘劑復(fù)合使用，不但能提高對天牛的誘蟲率，還可以引誘到未交配，未產(chǎn)卵的松墨天牛，提早誘殺帶線蟲的松墨天牛，更有效地抑制松材線蟲病的傳播蔓延和松墨天牛的危害。

墨天牛作為傳播松材線蟲的媒介昆蟲，其化學(xué)通訊的研究受到學(xué)者們的高度關(guān)注。已經(jīng)鑒定出樟子松墨天牛的雌雄成蟲主要產(chǎn)生接觸性性信息素，成熟雄蟲可以產(chǎn)生短距離性信息素;松墨天牛被認為不存在接觸性性信息素［11］。并且已經(jīng)鑒定出1種由雄性特異性產(chǎn)生的短距離性信息素的成分為2-十一烷氧基-1-乙醇。然而與鱗翅目昆蟲相比，墨天?；瘜W(xué)通訊研究還存在差距。目前鱗翅目昆蟲已鑒定出350多種性信息素，同時在嗅覺機制上對氣味結(jié)合蛋白的研究已取得一定成果，近年來開始在分子水平上進一步探索信息素生物合成激活神經(jīng)肽(pheromone biosynthesis activating neumpepide，PBAN)的生理功能及其基因表達［21］，對墨天牛的化學(xué)生態(tài)的研究均有一定的參考價值。相信隨著生測、誘捕技術(shù)的不斷改進以及合成技術(shù)、分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，天?；瘜W(xué)通訊的研究將會邁上新的臺階，在害蟲綜合管理中發(fā)揮更大的作用。

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