王新苗,張淑華,索云成,劉婧怡,齊安國

（1.伊春林業(yè)學(xué)校,黑龍江伊春153000；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

矮叢藍(lán)莓Vaccinium angustifolium為杜鵑花科E r i c a c e a e越橘屬Vaccinium植物,小漿果類果樹,又稱矮叢越橘[1].其營養(yǎng)豐富,是美味滋補(bǔ)佳品,不但可以鮮食,還可以制成多種加工品,在國際市場上享有盛譽(yù).傳統(tǒng)的扦插、壓條等繁殖方法繁殖系數(shù)和出苗率低,難以滿足迅速推廣優(yōu)良品種的需要.因此,本文采用矮叢藍(lán)莓莖段作為外植體建立一個離體再生體系,以期為矮叢藍(lán)莓快速繁殖和進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試矮叢藍(lán)莓品種,取自遼寧省撫順市清原縣,分別為：‘北極星’（Polaris）、‘美登’（BlomIDon）.

1.2 試驗方法

1.2.1 初代培養(yǎng)在4月初進(jìn)行滅菌方案的篩選.以‘北極星’、‘美登’帶腋芽莖段為試材,用流水沖洗20~30 m i n.在超凈工作臺上,先用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸漬30 s,再用無菌水沖洗1遍,接著以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的H g C l2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的Na ClO為滅菌劑,對應(yīng)不同的消毒時間進(jìn)行進(jìn)一步消毒,最后用無菌水沖洗5遍,待用.以上操作采用WPM+6-B A2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L作為培養(yǎng)基,每個處理接種40個外植體,重復(fù)3次.30d后調(diào)查各處理的死亡率、污染率及成活率,篩選出外植體消毒的最佳方案.以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-B A、NAA,將滅菌后的‘北極星’、‘美登’的帶腋芽莖段分別接種于上述培養(yǎng)基上,每天觀察6-B A及NAA組合對外植體誘導(dǎo)的影響,30 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計.

1.2.2 繼代與增殖培養(yǎng)以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,采用L9（34）正交試驗做3因素3水平處理,測定3種植物生長調(diào)節(jié)劑（6-B A、NAA、ZT）處理30 d后的增殖系數(shù)和生長狀況；將接種在WPM+6-B A0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+ZT2 mg/L基本培養(yǎng)基上的外植體,分別經(jīng)0、7、14 d暗培養(yǎng)處理,然后轉(zhuǎn)移到光照下培養(yǎng)30 d后調(diào)查,測定暗培養(yǎng)對增殖培養(yǎng)的影響；測定不同轉(zhuǎn)種周期（30、40、50 d）的試管苗嫩梢形態(tài)和生長狀況,以選擇外植體最佳的轉(zhuǎn)種周期.

1.2.3 壯苗及生根培養(yǎng)不定芽增殖得到的植株表現(xiàn)細(xì)弱,為了讓其生根,本研究在不添加任何生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng).20 d后,選擇生長健壯的植株,在1/2 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)其生根,每個處理30瓶,每瓶1個單株,重復(fù)3次.30 d后觀察統(tǒng)計生根率及試管苗生長情況.

1.3 試驗結(jié)果評測指標(biāo)

材料接種后,定期觀察記錄生長情況,主要統(tǒng)計指標(biāo)及計算公式如下[2]：

死亡率/%=死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

污染率/%=污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

成活率/%=成活的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

誘導(dǎo)率/%=萌發(fā)出葉片的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

生根率/%=生根的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

增殖系數(shù)/%=增殖后的芽苗數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

2.1.1 不同消毒處理對外植體表面的消毒效果不同消毒處理對外植體表面的消毒效果見表1.

表1 不同滅菌方式的滅菌效果Tab.1 Effect of different sterilizati on methods

由表1可知,不同處理對‘北極星’、‘美登’的死亡率、污染率和成活率影響不同.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的H g Cl2滅菌時,A2處理2個品種的成活率均最高,分別為90%、92.5%,滅菌效果明顯,與其他處理差異顯著.隨著HgCl2消毒時間的延長,污染率均降低,但對外植體造成了傷害,致使死亡率升高,不同品種之間存在一定差異.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的Na ClO滅菌時,‘北極星’A5處理成活率最高為75%,而‘美登’A4處理成活率最高為77.5%,這可能與材料生長狀態(tài)有關(guān).就滅菌試劑的種類而言,Hg Cl2滅菌效果明顯好于Na ClO的效果.

綜合分析死亡率、污染率和成活率的測定結(jié)果,2個品種均確定A 2處理即體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇30 s+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Hg Cl28 m in為最佳消毒處理方案.

2.1.26-B A及NA A組合對外植體誘導(dǎo)的影響6-B A及NAA組合對外植體誘導(dǎo)的影響見表2.

表2 6-BA及NAA組合對帶腋芽莖段誘導(dǎo)率的影響Tab.2 Effect of different combinations of 6-BA and NAA on induction of stem with axillary bud

由表2可知,‘北極星’以WPM+6-B A3mg/L+NAA0.2mg/L為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基,‘美登’則以WPM+6-B A2 mg/L+NAA0.2 mg/L為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基,其誘導(dǎo)率分別為72.5%和74.29%,與其他激素組合差異顯著.2個品種的誘導(dǎo)培養(yǎng)基相差較大,這說明不同基因型的品種在腋芽的誘導(dǎo)上存在較大差異.在低濃度6-B A時,萌發(fā)的葉片大,而且葉色深綠,葉間距較大.而6-B A濃度增大時,葉片變得窄小,葉色變淺,葉間距縮短,葉片呈叢生狀.在同樣的6-B A濃度下,NAA質(zhì)量濃度為0.1~0.2 mg/L時,誘導(dǎo)率差異不顯著,苗芽生長健壯,顏色為綠色或深綠色；當(dāng)NAA濃度為0.3 mg/L時,雖然誘導(dǎo)率差異不顯著,但是愈傷組織略有增加.

2.2 繼代與增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對試管苗增殖生長的影響不同生長調(diào)節(jié)劑組合對‘北極星’、‘美登’試管苗增殖生長的影響分別見表3、表4.

表3 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對‘北極星’增殖生長的影響Tab.3 Effect of different hormone combinations on proliferation of' Polaris'

由表3極差分析可知,本試驗3個因素對‘北極星’的增殖影響依次是ZT＞6-B A＞NAA,這表明ZT是‘北極星’增殖的重要因素.通過分析均值（K）,可以推斷最佳組合為C 3,此時的增殖系數(shù)最高達(dá)4.83,與其他處理組合差異顯著,并且試管苗生長健壯,芽苗分化較多,葉片嫩綠,展開,效果最好.因此,‘北極星’增殖適宜的培養(yǎng)基為WPM+6-B A0.3 mg/L+NAA0.5 mg/L+ZT 2 mg/L.由表4可知,本試驗3個因素對‘美登’的增殖影響依次是ZT＞6-B A＞NAA.通過分析均值（K）,可以推斷最佳組合為6-B A1 mg/L+NAA0.1 mg/L+6-B A2 mg/L.從實(shí)際觀察數(shù)據(jù)來看,C 7處理增殖系數(shù)最高,達(dá)到5.21,與其他處理組合差異顯著,并且試管苗長勢較好,分化較快,葉片濃綠,展開葉片較多,生長健壯.因此,應(yīng)選擇WPM+6-B A1 mg/L+NAA0.05 mg/L+ZT 2 mg/L為最適培養(yǎng)基.

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對‘美登’增殖生長的影響Tab.4 Effect of different hormone combinations on proliferation of' BlomIDon'

2.2.2 光照條件對試管苗增殖的影響光照條件對試管苗增殖的影響見表5.由表5可知,經(jīng)過7 d暗培養(yǎng),2個品種的增殖系數(shù)均達(dá)到最高,分別為3.26和4.08,與其他處理差異顯著.并且此時的嫩莖粗壯,葉色嫩綠,叢生芽較多,生長較快,說明經(jīng)過7 d暗培養(yǎng),促進(jìn)了叢生芽的生長和分化,對苗有利.雖然接種后直接進(jìn)行光下培養(yǎng),2種試管苗也能正常生長,但是其叢生芽分化較少,增殖較慢；而接種后經(jīng)過14 d暗培養(yǎng),試管苗的葉色發(fā)黃,葉片卷曲,整個植株都出現(xiàn)松散的狀況,增殖效果也不佳.因此,接種后7 d暗培養(yǎng)對‘北極星’和‘美登’增殖效果最佳.

表5 不同光照條件對繼代增殖的影響Tab.5Effect of different light conditions on proliferation

2.2.3 不同轉(zhuǎn)種周期對試管苗增殖的影響不同轉(zhuǎn)種周期對試管苗增殖的影響見表6.

表6 不同轉(zhuǎn)種周期對繼代增殖的影響Tab.6Effect of different cycle of turning on proliferation

由表6可知,試驗中‘北極星’和‘美登’的轉(zhuǎn)接周期有些差異.‘北極星’在培養(yǎng)30 d時,增殖系數(shù)最高為4.25,與其他處理差異顯著,葉色嫩綠,生長較快,叢生芽分化較多.隨著時間的延長,大部分葉片保持綠色,有些嫩梢頂端枯黃,下部葉變黃,少數(shù)枯死；50 d時,上部葉也開始變黃,有些莖尖已經(jīng)干枯,下部葉片幾乎全部枯死.‘美登’在培養(yǎng)30 d時,增殖系數(shù)為2.19,葉片生長狀況較好,上葉嫩綠,下葉深綠；在培養(yǎng)40 d時,增殖系數(shù)上升為3.07,與其他處理差異顯著,葉片嫩綠,叢生芽較多,生長較快；但50 d后,增殖系數(shù)下降至1.47,葉片枯黃,植株生長緩慢,甚至枯死.所以,‘北極星’最佳轉(zhuǎn)種周期為30 d,而‘美登’最佳轉(zhuǎn)種周期為40 d.

2.3 壯苗及生根培養(yǎng)

壯苗后,生根培養(yǎng)約2周時,小苗底部開始形成白色的根點(diǎn),20 d左右即可長出小根,根白色.不同濃度I B A和活性炭（A C）用量對‘北極星’和‘美登’生根的影響見表7.

表7 不同濃度的生長素和活性炭對試管苗生根的影響Tab.7 Effect of different auxin and AC on rooting of rooting plantlets

由表7可知,在不加I B A和活性炭的培養(yǎng)基中,均沒有根形成.在附加不同濃度I B A和活性炭的培養(yǎng)基上,2種矮叢藍(lán)莓均可生根,但生根效果不同.‘北極星’以1/2 MS+I B A0.2 mg/L+活性炭0.1%作為生根培養(yǎng)基效果最好,生根率達(dá)53.33%,根多,粗壯,與其他組合差異顯著；‘美登’以1/2 MS+I B A0.1 mg/L+活性炭0.1%生根率最高,達(dá)到66.67%,均勻整齊,植株生長健壯.

3 結(jié)論與討論

木本植物組織培養(yǎng)的困難之一是建立無菌材料[2].本文以2種矮叢藍(lán)莓莖段作外植體,篩選出最佳的滅菌方式均為：體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇30 s+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的H g C l28 min,此時成活率均最高.

已有研究表明,and ers on、WPM和MS培養(yǎng)基均適合藍(lán)莓組培,但WPM的效果最好[3].本試驗采用WPM、1/2 MS作為基本培養(yǎng)基,試驗證明,‘北極星’的啟動培養(yǎng)基宜采用WPM+6-B A3 mg/L+NAA0.2 mg/L,增殖培養(yǎng)基為WPM+6-B A0.3 mg/L+NAA0.5 mg/L+ZT 2 mg/L,生根培養(yǎng)基為1/2 MS+I B A0.2 mg/L+A C 0.1%；‘美登’的啟動培養(yǎng)基宜采用WPM+6-B A2 mg/L+NAA0.2 mg/L,增殖培養(yǎng)基為WPM+6-B A1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+ZT 2 mg/L,生根培養(yǎng)基為1/2 MS+I B A0.1 mg/L+A C0.1%.

在芽的增殖培養(yǎng)中,細(xì)胞分裂素的作用至關(guān)重要[4-5],因此本試驗研究了在含有6-B A的基礎(chǔ)上,添加ZT的效果.結(jié)果表明,在添加2 mg/L的ZT進(jìn)行增殖培養(yǎng),增殖效果明顯,植株生長健壯.在生根培養(yǎng)方面,本試驗添加了A C,效果也相當(dāng)顯著,根粗壯,生根率也較文獻(xiàn)[6]的試驗結(jié)果明顯提高.

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