國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心;山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南市 250101）

人體血液是由55%～60%的血漿和40%～45%的血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板）組成的。紅細(xì)胞的機(jī)能是運(yùn)送氧氣到身體各部，并將代謝產(chǎn)生的二氧化碳送到肺部隨呼氣而排出體外。血漿中的90%是水，其余為白質(zhì)、鈉、鉀、激素、酶等人體新陳代謝所需要的物質(zhì)，維持人體正常生命活動(dòng)。紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿血紅蛋白，約占紅細(xì)胞質(zhì)量的33%，它具有結(jié)合與運(yùn)輸O2和CO2的功能，紅細(xì)胞的滲透壓與血漿相等，使出入紅細(xì)胞的水分維持平衡。當(dāng)血漿滲透壓降低時(shí)，過量水分進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞膨脹成球形，甚至破裂，血紅蛋白逸出，喪失其功能，稱為溶血。引起溶血的原因有機(jī)械力如壓力和流變以及生物化學(xué)等方面的因素，溶血的發(fā)生在臨床上可能帶來一些不利影響，如可能導(dǎo)致肝臟和腎臟的嚴(yán)重?fù)p傷及血栓的形成，對(duì)腦或其他器官產(chǎn)生繼發(fā)損害。

ISO-10993.4[1]中指出溶血是一項(xiàng)很有意義的篩選試驗(yàn)。在試驗(yàn)操作規(guī)范的情況下，血漿血紅蛋白量升高指示溶血并反映出在與材料和器械接觸中紅細(xì)胞膜的易破裂性。與循環(huán)血液接觸的器械或器械部件常規(guī)需要進(jìn)行溶血性能的評(píng)價(jià)，能夠評(píng)價(jià)溶血的方法有很多種，有體內(nèi)、半體內(nèi)和體外與血液或血液成分接觸方法，但常見的是采用體外法。體外試驗(yàn)一般用于評(píng)價(jià)紅細(xì)胞損傷，有直接法和間接法。直接法可測(cè)定由于物理和化學(xué)因素對(duì)紅細(xì)胞影響導(dǎo)致的溶血，間接法測(cè)定試驗(yàn)樣品浸提物導(dǎo)致的溶血。ISO-10993.4 中列出了溶血試驗(yàn)的總則、可選擇的血紅蛋白總量測(cè)定和血漿或上清液血紅蛋白濃度的測(cè)定方法，但并沒有具體描述試驗(yàn)過程以及選擇試驗(yàn)方法的原則，所以各個(gè)醫(yī)療器械檢測(cè)和評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平選擇的檢測(cè)方法有所不同。

目前國(guó)際上明確的、公認(rèn)的用于評(píng)價(jià)醫(yī)療器械或醫(yī)療器械材料的溶血性能的方法主要有三種：NIH（National Institutes of Health，國(guó)家健康機(jī)構(gòu)）法[2]、ASTM（American Society for Testing and Materials，美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)）F756-2008[3]和MHLW（日本勞動(dòng)健康福利局）[4]的溶血方法。本文對(duì)此三種方法方法進(jìn)行總結(jié)比較，分別列出了他們?cè)谔幚順悠?、檢測(cè)原理、檢測(cè)方式等一些指標(biāo)方面的特點(diǎn)。

1.一般情況比較

三種方法都是通過分光光度計(jì)法，在波長(zhǎng)540nm 或545nm 處測(cè)定試驗(yàn)樣品或其浸提液接觸的血液上清液的吸光度值，通過計(jì)算溶血率來評(píng)價(jià)溶血的程度。對(duì)比參照方面三者有些不同：NIH 采用0.1%碳酸鈉溶液與生理鹽水作為陽性與陰性對(duì)比參照，ASTM 方法和MHLW 方法都采用注射用水作為陽性對(duì)照，但采用的陰性對(duì)照則不同：前者是CMF-PBS，后者是生理鹽水。實(shí)驗(yàn)試劑方面：NIH 方法不采用其他實(shí)驗(yàn)試劑，ASTM 方法采用血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與氰化正鐵血紅蛋白作為試劑，MHLW 方法采用Drabkin’s Reagent 作為試劑。具體情況見表1。

表1.三種溶血試驗(yàn)方法一般情況比較

2.血源比較

三種方法都要求采用新西蘭白兔，MHLW 對(duì)白兔的要求更為細(xì)致，但三種方法所使用的抗凝劑和對(duì)血液的處理完全不同。NIH 采用8mL 兔血，用草酸鹽抗凝，并用10ml 生理鹽水進(jìn)行稀釋，通過測(cè)定其與碳酸鈉混合物的吸光度判斷其可用性。ASTM 方法要求3 只兔子分別抽取5ml 血液進(jìn)行混合，用檸檬酸鹽抗凝，需要對(duì)血液的血紅蛋白含量進(jìn)行測(cè)定和調(diào)整。MHLW 方法對(duì)血源要求較具體，對(duì)兔子的種類、月齡、體重和健康狀況等要求詳細(xì)，并且要對(duì)血液進(jìn)行處理使其去纖維蛋白，通過測(cè)定吸光度判斷去纖維蛋白血源的可用性。具體情況見表2。

表2.三種溶血試驗(yàn)方法的血源比較

3.樣品處理方法比較

三種方法的試驗(yàn)溫度都是37 ±2℃。NIH 和ASTM 都有直接接觸和間接接觸兩種方法，可以根據(jù)器械本身和其將來使用的條件選擇試驗(yàn)，而MHLW 則直接采用間接接觸法。采用間接接觸方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)的浸提液制備方法都按照ISO-10993.12 執(zhí)行。ISO-10993.12 是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)制定的關(guān)于醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)樣品制備和參照樣品的指導(dǎo)性標(biāo)準(zhǔn)。直接接觸法時(shí)，NIH 一般采用5g 樣品10ml 生理鹽水的比例，ASTM 則采用42cm2或21cm2或1.4g 樣品加7ml CMF-PBS 的比例。浸提時(shí)間方面：NIH 方法浸提時(shí)間最短，與血液接觸的時(shí)間是60min，ASTM 的接觸時(shí)間是至少3h，而MHLW 方法與其他兩種最大的區(qū)別是樣品與血液接觸時(shí)間為4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別是1h、2h、3h 和4h。結(jié)果測(cè)定：對(duì)于NIH 方法規(guī)定陽性對(duì)照的吸光度值應(yīng)≥ 0.850，陰性對(duì)照的吸光度值應(yīng)<0.100，否則應(yīng)重新試驗(yàn)。其他兩種方法未做要求，但是都要用到特定的試劑。具體情況見表3。

表3.三種溶血試驗(yàn)樣品處理方法比較

4.結(jié)果計(jì)算和判定方法比較

NIH 法和MHLW 比較相似，同時(shí)測(cè)定陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的吸光度值，換算出標(biāo)準(zhǔn)化的溶血率，根據(jù)溶血率大小判斷器械或其浸提液是否具有溶血特性。只是在NIH 的間接接觸法應(yīng)用時(shí)去除了浸提液（不與血液接觸）的本底值。ASTM 方法通過測(cè)定樣品吸光度和接觸樣品前全血的吸光度，同時(shí)去除空白管的吸光度值而計(jì)算出溶血率，實(shí)際計(jì)算出的結(jié)果是游離血紅蛋白的含量占總的血紅蛋白的百分比。三者的具體計(jì)算方式和結(jié)果判定方法見表4，可以看出MHLW 法在結(jié)果判定方面較其他兩種方法分級(jí)多，分為5級(jí)，且溶血率的分級(jí)區(qū)間也比較大。具體情況見表4。

綜合以上比較結(jié)果可以看出：NIH 法在應(yīng)用方面因?yàn)樵囼?yàn)時(shí)間短，沒有應(yīng)用特定試劑而最省時(shí)省力，且節(jié)約成本。而且使用間接接觸法測(cè)定結(jié)果時(shí)，因?yàn)槿コ私嵋海ú慌c血液接觸）的本底值，這樣可以去除醫(yī)療器械或材料浸提物顏色的干擾，客觀評(píng)價(jià)這類器械或材料的溶血性能。MHLW 方法除了在血源方面的處理和孵育時(shí)間方面與其他兩種方法有差異外，其與NIH 方法基本相似。ASTM 方法對(duì)血漿血紅蛋白進(jìn)行定量測(cè)量，試驗(yàn)過程較其他兩種方法復(fù)雜，應(yīng)用了血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和氰化正鐵血紅蛋白試劑，為所有使用該法的實(shí)驗(yàn)室提供了可比性。該方法的主要缺點(diǎn)是使用氰化物溶液存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。氰化試劑在各種接觸方式下都具有毒性，并且遇酸釋放 HCN，試劑和產(chǎn)品的處置比較麻煩而且費(fèi)用較高。

表4.三種溶血試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算和判定方法比較

以上對(duì)三種方法的比較是基于目前公認(rèn)的試驗(yàn)步驟而進(jìn)行的，在實(shí)際被各個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的過程中會(huì)有一些輕微變動(dòng)如對(duì)于血液的收集，有報(bào)道[6]稱ASTM 方法采用一只兔的血液是可行的，再如NIH 法的陽性對(duì)照采用注射用水或者是對(duì)血液的處理進(jìn)行簡(jiǎn)化，只對(duì)陽性和陰性對(duì)照的吸光度范圍做出要求[7～8]。

雖然三種方法在國(guó)際上應(yīng)用比較廣泛，但是使用標(biāo)準(zhǔn)材料對(duì)這三種方法的比較研究是不完全的或不存在的。為了給這三種方法結(jié)果的互換性提供全面的比較信息，ISO/TC194 工作組正在組織國(guó)際上影響力較大的實(shí)驗(yàn)室（Nelson、NAMSA、WuXi AppTec、Caridian BCT、Gambro、BD 、日本和我中心）進(jìn)行溶血比對(duì)試驗(yàn)（Round-robin）[9]。由工作組總結(jié)討論影響試驗(yàn)結(jié)果的各項(xiàng)因素，對(duì)三種試驗(yàn)方法的細(xì)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化、規(guī)定，決定采用統(tǒng)一的材料（高、中、低溶血性材料）、統(tǒng)一的浸提條件（溫度、時(shí)間、浸提比例和浸提介質(zhì)）、統(tǒng)一的血液來源（兔血和人血）、統(tǒng)一的抗凝劑等方面的因素來進(jìn)行這次比對(duì)試驗(yàn)。此次比對(duì)試驗(yàn)通過使用共同的醫(yī)療器械（公認(rèn)的非溶血、低溶血和溶血性材料）和對(duì)照材料，比較三種試驗(yàn)方法的結(jié)果是否一致，是否符合材料的溶血性能預(yù)期，同時(shí)也比較各個(gè)試驗(yàn)方法和血源（兔或人血）及不同實(shí)驗(yàn)室之間的一致性問題。最終會(huì)將此三種方法的具體過程列入新一版的ISO-10993.4 中，能更直接明確地指導(dǎo)醫(yī)療器械或醫(yī)療器械材料的溶血性能評(píng)價(jià)。

[1]ISO 10993-4:2002/Amd 1:2006.Biological evaluation of medical devices -Part 4:Selection of tests for interactions with blood.

[2]National Institutes of Health.Evaluation of hemodialyzers and dialysis membranes.Report of a Study Group for the Artificial Kidney-Chronic Uremia Program NIAMDD-1977.Chapter two.In vitro characterization of hemodialyzers.ArtifOrgans 1977;1(2):59-77.

[3]ASTM F 756-08.Standard Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials.

[4]Ministry of Health,Labour and Welfare(MHLW),Japan:Testing Methods to Evaluate Biological Safety of Medical Devices, Notice from the office medical devices evaluation number 36,2003

[5]ISO 10993-12,Biological evaluation of medical devices -Part 12:Sample preparation and reference materials

[6]張伶俐， 朱蔚精，譚言飛，等.生物材料溶血性標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)方法比較：溶血率法和氰化高鐵血紅蛋白法[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2004，21( 1)：111-114

[7]GB/T 16175-1996,Organic silicone material for medical use -Biological evaluation test methods.

[8]GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2 部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法

[9]ANSI/AAMI/ISO 10993-4:2002(R2009)&A1:2006(R2009)Biological Evaluation of Medical Devices-Part 4:Selection of tests for the interaction with blood.Association for the Advancement of Medical Instrumentation.Arlington,VA.Hemolysis Round Robin Draft Protocol