李 鑫，劉 騫，韓建春，李 菁

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆?jié)饪s蛋白（簡(jiǎn)稱SPC）是用高質(zhì)量的低溫變性豆粕為主要生產(chǎn)原料，通過(guò)醇法或酸法除去醇溶性和/或水溶性后所制得的含有65%～90%（干基）蛋白質(zhì)（N×6.25）的粉狀大豆蛋白產(chǎn)品。目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠家一般采用醇法生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白，其主要原因是醇法大豆?jié)饪s蛋白豆腥味較低，而且生產(chǎn)時(shí)不產(chǎn)生廢水，使得醇法大豆?jié)饪s蛋白成為市場(chǎng)上主要的大豆?jié)饪s蛋白。但醇法大豆?jié)饪s蛋白在加工過(guò)程中，由于乙醇的作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這樣很大程度上制約著大豆?jié)饪s蛋白的應(yīng)用。因此，加強(qiáng)和改善大豆?jié)饪s蛋白的理化特性以及其他生物活性，擴(kuò)大其在食品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用，成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。

將碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上的α或ε-氨基或羧基相結(jié)合形成糖基化蛋白的化學(xué)反應(yīng)稱之為蛋白質(zhì)的美拉德修飾作用[1]，主要包括縮合、降解、裂解、聚合等一系列反應(yīng)。糖基化反應(yīng)是自然條件下發(fā)生的非酶褐變，是食品加工和保存過(guò)程中涉及廣泛的蛋白質(zhì)與多糖和小分子等碳水化合物發(fā)生的反應(yīng)。另外，美拉德反應(yīng)的速率主要受到反應(yīng)物的組成、時(shí)間、溫度、反應(yīng)物濃度、pH等多種因素影響[2-6]。美拉德修飾可在一定程度上克服蛋白質(zhì)遇熱不穩(wěn)定問(wèn)題，與化學(xué)和酶法對(duì)蛋白質(zhì)改性相比，不需化學(xué)試劑，安全性高，可極大改善蛋白質(zhì)的乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性及抗氧化性等功能特性。管軍軍等人利用微波輻射的方法，合成了大豆分離蛋白—乳糖復(fù)合物，從功能性的研究表明，大豆分離蛋白—乳糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶解性與熱穩(wěn)定性較大豆分離蛋白有顯著的提高，而且抗氧化性也隨之增加[7]。姜瞻梅等人研究乳清蛋白與7種不同的還原糖通過(guò)干熱美拉德反應(yīng)，測(cè)定其反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)特性，表明乳清蛋白糖基復(fù)合物的游離氨基酸含量均顯著降低，同時(shí)抗氧化活性明顯增強(qiáng)[8]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆蛋白美拉德反應(yīng)的研究，主要集中在對(duì)大豆蛋白的功能特性等方面的改善作用[9-10]，而對(duì)大豆蛋白—還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物特性以及其抗氧化活性的研究在我國(guó)未見(jiàn)太多報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定3種還原糖（葡萄糖、果糖與木糖）和大豆?jié)饪s蛋白反應(yīng)不同時(shí)間產(chǎn)生美拉德產(chǎn)物的理化性質(zhì)和抗氧化活性（主要包括pH值、色差值、游離氨基含量、還原能力和自由基清除能力），系統(tǒng)分析還原糖種類和反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆?jié)饪s蛋白—還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物理化特性和抗氧化活性的影響，可為大豆?jié)饪s蛋白糖基復(fù)合物作為天然色素和天然抗氧化劑的應(yīng)用提供基本的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆?jié)饪s蛋白（65%蛋白含量）：黑龍江雙河松嫩大豆生物工程有限責(zé)任公司；葡萄糖、果糖、木糖、鐵氰化鉀：上海國(guó)藥集團(tuán)；TNBS（2,4,6-三硝基苯磺酸）、ABTS（2,2′-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）：Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN-F自動(dòng)定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；JD500-2型電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；pHS-25型pH計(jì)：上海精科雷磁儀器廠；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16C型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；AL-104型精密電子天平：上海梅特勒—托利多儀器設(shè)備有限公司；WSC-S測(cè)色色差計(jì)：上海光學(xué)物理研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）的制備 稱取一定量的大豆?jié)饪s蛋白分別與還原糖均勻混合，SPC與還原糖的質(zhì)量比為11003d11，磁力攪拌至固體全部溶解，后用蒸餾水定容至100mL，使溶液中SPC和還原糖的濃度都為0.3mol/L。取上述溶液10mL轉(zhuǎn)移到25mL的具塞試管中，蓋緊。在95℃水浴中加熱0.5～6.0h，并每隔一段時(shí)間取樣，然后立即放入冰水中冷卻。獲得的MRPs在4℃下保存，用于分析其理化特性和抗氧化活性。

1.3.2 測(cè)定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH 用pH計(jì)測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間MRPs的pH。

1.3.3 顏色的測(cè)定 用色差儀測(cè)定，先按照間歇測(cè)試方式進(jìn)行色差儀的調(diào)試，然后取一定量的MRPs，將其放入比色皿中，并將測(cè)試探頭放在比色皿上進(jìn)行測(cè)定。使用O/D測(cè)試頭，可測(cè)定物體本身的顏色和光澤及各檢測(cè)樣之間的色度差值。白板的校正值為L(zhǎng)*=90.26，a*=-1.29，b*=5.18。

1.3.4 游離氨基含量的測(cè)定 參照Benjakul的方法[11]，取125μL 8倍稀釋的MRPs樣品與2.0mL、0.2125mol/L、pH為8.2的磷酸鹽緩沖液混合，再加入濃度為0.01%的TNBS溶液1.0mL，用漩渦振蕩器混合均勻，并在50℃水浴中避光保溫30min，然后加入2.0mL濃度為0.1mol/L的亞硫酸鈉終止反應(yīng)。反應(yīng)后的樣品在室溫下冷卻15min，在420nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，按同樣方法繪制出亮氨酸濃度與吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，根據(jù)測(cè)定樣品的吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得出樣品中的游離氨基含量。

1.3.5 還原能力的測(cè)定 采用Yen等人的方法[12]，做適當(dāng)修改。取0.5mL 8倍稀釋的樣品，加入2.5mL濃度為0.2mol/L、pH為6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5mL濃度為1.0%的鐵氰化鉀溶液，充分混合。將混合物在50℃水浴下保溫20min，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，然后將混合物在3000r下離心10min。取2.5mL上層清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，在700nm處測(cè)定其吸光值。

1.3.6 ABTS自由基清除活性的測(cè)定 參照Re等人的方法[13]，并稍作修改。用pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液配制7mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液，ABTS儲(chǔ)備液和最終濃度為2.45mmol/L的過(guò)二硫酸鉀反應(yīng)產(chǎn)生ABTS自由基，混合物預(yù)先在室溫黑暗處放置12～16h。穩(wěn)定后的ABTS自由基溶液，用pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液（20mmol/L）稀釋，使其在734nm處吸光度為0.7±0.02。然后取3mL該溶液與100μL MRPs樣品（8倍稀釋）充分混合，避光放置6min，在734nm處測(cè)定吸光度值。按照下面的公式計(jì)算ABTS自由基清除率：

式中：Ac為反應(yīng)前ABTS自由基溶液的吸光值，As為反應(yīng)后樣品溶液的吸光值。

1.3.7 羥基自由基清除 參照Lee等人的方法[14]，取0.75mM鄰二氮菲1mL，而后依次加入PBS液2mL和蒸餾水1mL，充分混合，再加入0.75mM硫酸亞鐵溶液1mL并混合均勻。然后加入0.01%過(guò)氧化氫1mL，在37℃下保溫60min，于536nm處測(cè)其吸光值，其值為AP。然后用1mL蒸餾水代替1mL過(guò)氧化氫，測(cè)得值即為AB。最后用8倍稀釋的MRPs樣品1mL代替之前試驗(yàn)中的1mL蒸餾水，測(cè)得值為AS。

清除率（%）=（AS-AP）/（AB-AP）×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1（分析軟件,St Paul,MN）軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P<0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH的變化

結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物pH的變化

由圖1可以看出，大豆?jié)饪s蛋白與3種還原糖美拉德反應(yīng)體系的pH隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，各反應(yīng)體系的pH均顯著下降（P<0.05），從初始的7.31～7.36，下降至6.86～7.08。還原糖種類的不同對(duì)反應(yīng)體系的pH有顯著影響，另外，大豆?jié)饪s蛋白—木糖反應(yīng)體系的pH下降最顯著（P<0.05）。pH的下降，不僅是因?yàn)樵诜磻?yīng)過(guò)程中羰氨縮合封閉了游離氨基，而且也與反應(yīng)過(guò)程中甲酸、乙酸等酸性物質(zhì)的生成有關(guān)[15]。Brands等研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白—葡萄糖體系中形成的有機(jī)酸含量比不添加酪蛋白的體系多，因此可以推斷，體系中有機(jī)酸的生成依賴于羰基基團(tuán)和氨基基團(tuán)中的碳氧雙鍵[16]。Li等人向大米蛋白中添加不同還原糖，研究美拉德反應(yīng)體系中pH的變化，結(jié)果表明大米蛋白和葡萄糖形成的MRPs樣品的pH要高于其他還原糖的MRPs樣品[17]。另外，在美拉德反應(yīng)的中間階段，由于一些具有緩沖能力的酸性化合物的產(chǎn)生，包括甲酸、醋酸、丙酮醛、乙二醛等，抑制了美拉德反應(yīng)體系的酸性，所以當(dāng)加熱時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，pH的降低趨于平穩(wěn)狀態(tài)。

2.2 顏色的變化

由圖2可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，大豆?jié)饪s蛋白與3種還原糖美拉德反應(yīng)體系的a*值顯著增加（P<0.05）。同時(shí)，相對(duì)于葡萄糖和果糖體系來(lái)說(shuō)，大豆?jié)饪s蛋白—木糖反應(yīng)體系的a*值增加最顯著（P<0.05）。Morales等人研究發(fā)現(xiàn)，MRPs中的大部分顏色主要產(chǎn)生在反應(yīng)的后期[5]。同時(shí)，不斷增加的a*值也說(shuō)明，在3種體系中的類黑精的產(chǎn)生是顏色變化的主要原因[18]。由于類黑精是以短肽和色素結(jié)合而成的混合體，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于產(chǎn)生色素物質(zhì)，從而加深反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度。

圖2 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物顏色的變化

2.3 游離氨基含量的變化

在加熱過(guò)程中，MRPs游離氨基含量的變化如圖3所示。

圖3 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物游離氨基含量的變化

隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆?jié)饪s蛋白與各還原糖反應(yīng)體系中的游離氨基含量都呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)（P<0.05），尤其在0～2h的加熱時(shí)間內(nèi)，各體系中游離氨基含量明顯持續(xù)下降（P<0.05）。在美拉德反應(yīng)過(guò)程中，其游離氨基含量的變化一定程度上反映美拉德反應(yīng)的進(jìn)程，所消耗的游離氨基越多,反應(yīng)越徹底。這個(gè)結(jié)果表明，當(dāng)加熱進(jìn)行時(shí)，蛋白質(zhì)或氨基酸的α-或ε-NH2基團(tuán)更大程度的與糖共價(jià)結(jié)合形成糖基化蛋白，同時(shí)，MRPs重新排列成一個(gè)更穩(wěn)定的酮胺或阿馬杜里產(chǎn)物[19]。

2.4 還原能力的變化

還原能力的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原能力的變化

從700nm處吸光度的變化曲線可以看出，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，各體系中MRPs的還原能力顯著增加（P<0.05），大豆?jié)饪s蛋白—木糖體系的MRPs的還原能力要顯著高于其他兩種還原糖反應(yīng)體系（P<0.05）。Yoshimura等人研究表明，蛋白質(zhì)—還原糖MRPs的還原能力與顏色變化程度有良好的線性關(guān)系，反應(yīng)體系褐變程度越深，還原能力越高[20]。Morales等人通過(guò)研究指出，在葡萄糖—賴氨酸MRPs中存在許多能消除過(guò)氧化物的化合物（主要存在于褐色素中），過(guò)氧化物間接引發(fā)脂類氧化[5]。另外，MRPs顯著抗氧化能力很可能與它們強(qiáng)有力消除過(guò)氧化物有關(guān)。

2.5 ABTS和羥基自由基清除活性的變化

如圖5（a）所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各體系中MRPs的ABTS自由基清除活性顯著增加（P<0.05），與還原能力相同，木糖反應(yīng)體系產(chǎn)生的MRPs的ABTS自由基清除活性要顯著高于其他兩種還原糖反應(yīng)體系（P<0.05）。以反應(yīng)時(shí)間6h為例，木糖體系產(chǎn)生的MRPs對(duì)ABTS自由基清除活性可達(dá)52.90%，而葡萄糖和果糖產(chǎn)生的MRPs的ABTS自由基清除活性分別為40.14%和44.43%。尹姿等人研究發(fā)現(xiàn)，木糖—甘氨酸產(chǎn)生的MRPs對(duì)ABTS自由基的清除能力隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)[21]；同時(shí)，隨著反應(yīng)產(chǎn)物濃度的增大，其清除率逐漸增大，濃度為3.2mg/mL時(shí)，自由基清除率達(dá)到了98.5%左右。

圖5 不同加熱時(shí)間產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物ABTS自由基（a）與羥基自由基（b）清除活性的變化

如圖5（b）所示，與ABTS自由基清除活性相似，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各反應(yīng)體系的羥基自由基清除率均顯著增強(qiáng)（P<0.05），木糖體系MRPs的羥基自由基清除率提高最為顯著（P<0.05）。MRPs在發(fā)揮抗氧化作用時(shí)，有可能是作為氫供體，其本身也是金屬螯合劑，可以螯合Fe2+，因此MRPs擁有比較強(qiáng)的羥基自由基清除能力，也有可能與具有螯合Fe2+的能力有關(guān)[22]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)3種還原糖分別與大豆?jié)饪s蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)，研究其產(chǎn)物的理化特性及抗氧化活性。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證實(shí)該反應(yīng)是一個(gè)酸度和顏色逐漸增強(qiáng)的反應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中均有一定的新物質(zhì)產(chǎn)生，反應(yīng)過(guò)程中所生成的MRPs具有良好的抗氧化功能，其中木乳糖反應(yīng)體系得到的MRPs具有最高程度的褐變和最顯著的還原能力以及自由基清除能力。因此，大豆?jié)饪s蛋白—還原糖反應(yīng)體系產(chǎn)生的MRPs可以作為一種抗氧化劑來(lái)防止食物的脂質(zhì)氧化。

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