李 響， 李向麗， 譚貴良， 吳世嘉， 王周平*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.中山火炬職業(yè)技術學院，廣東 中山528436；3.中山市質量計量監(jiān)督檢測所，廣東 中山523290）

黃曲霉廣泛存在于土壤、灰塵、植物及其果實上，食品原材料特別容易受黃曲霉毒素污染。各類黃曲霉毒素中，以黃曲霉毒素B1的毒性最大，且有致癌性，許多國家規(guī)定了黃曲霉毒素在食品中的極限值，因此對黃曲霉毒素的檢測也成為食品安全領域的研究重點之一。傳統(tǒng)的黃曲霉毒素檢測方法，如薄層層析法、高效液相色譜法、微柱法、酶聯(lián)免疫吸附法等各有其優(yōu)缺點，因此有必要發(fā)展更簡便靈敏的新型檢測方法。利用半導體納米晶體進行熒光生物標記是近年來的研究熱點之一[1]。半導體量子點通常是由兩種或兩種以上的Ⅰ～Ⅶ、Ⅱ～Ⅵ或Ⅲ～Ⅴ族元素組成，而目前較成熟的量子點是由Ⅱ～Ⅵ或Ⅲ～Ⅴ族元素組成，如 CdSe、CdS、ZnS[2-3]等，它們簡便易得，分析穩(wěn)定性高[4]。量子點在生物、醫(yī)藥、食品等方面的應用主要是對細胞標記[5-6]以及基于DNA的標記檢測，其突出特點是靈敏度高[7]。

本研究中采用水相合成法制備巰基丙酸包裹的CdTe量子點，將量子點標記在免疫抗體上，基于競爭免疫反應并結合磁性納米材料的磁分離富集作用，有效地提高了檢測靈敏度，開發(fā)了一種黃曲霉毒素B1的新型高靈敏檢測方法。實驗將AFB1人工抗原（AFB1-BSA）與氨基化Fe3O4磁性納米粒子結合，制備AFB1人工抗原功能化Fe3O4磁性納米粒子作為捕獲探針 （AFB1-BSA-Fe3O4NPs）。同時將CdTe量子點與羊抗兔-IgG（二抗）結合，構建熒光信號探針（IgG-CdTe QDs）。競爭免疫反應中，標準黃曲霉毒素B1或樣品中的黃曲霉毒素B1與AFB1-BSA-Fe3O4NPs競爭性結合AFB1單克隆抗體 （一抗）；隨后施加外源磁場分離富集形成的一抗與捕獲探針的免疫復合物，再加入熒光信號探針，通過一抗與二抗的免疫親和，形成捕獲探針-一抗-顯示探針的免疫復合物，磁分離富集純化后測定熒光強度，以此來定量目標物質AFB1含量。新方法將發(fā)光量子點標記技術、熒光分析技術、磁分離富集技術與競爭免疫分析技術有機結合，具有特異性強、靈敏度高、分析時間短、操作簡便等特點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巰基丙酸、對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、黃曲霉毒素B1單克隆抗體、羧甲基羥胺半鹽酸鹽，購于Sigma Aldrich公司；黃曲霉毒素B1，購于北京泰勒奇科技有限公司；碲粉，購于Alfa Aesar公司；羊抗兔IgG、SP132582透析袋，購于上海生工生物工程技術服務有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，購于碧云天生物技術研究所；薄層層析硅膠板，購于上海上邦實業(yè)有限公司；氯仿、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶、四氫呋喃、水合氯化鎘、硼氫化鈉、質量分數25%的戊二醛，以及無水乙醇、丙酮、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等，購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 主要儀器

UV2300型雙光束紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司制；F-7000型熒光分光光度計，日本島津制；Zenyth3100型熒光/化學發(fā)光分析儀，奧地利Anthos制；5430R臺式高速冷凍離心機，德國Ceppendorf制；Biorad電泳儀，美國Bio-Rad伯樂公司制；Biorad凝膠成像儀，美國Bio-Rad伯樂公司制；DF-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司制；HYG-Ⅱa回轉式恒溫調速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設備有限公司制；DF-101S型集熱式磁力加速攪拌器，江蘇省金壇市通濟儀器廠制；KJ-300型超聲波清洗器，無錫科杰電子儀器公司制；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus制；JEM2100型透射電鏡，日本JEOL公司制；傅里葉紅外光譜儀，美國 Bio-Rad公司制；Waters Platform ZMD 4000 ESI質譜儀，美國 Waters公司制；另有Dmax-IIIB X-射線衍射儀等。

2 試驗步驟

2.1 材料準備

2.1.1 CdTe量子點的合成與表征 借鑒Zhang，李太山等的方法[8-9]并加以改進，制備CdTe發(fā)光量子點，具體步驟如下。

1）碲氫化鈉的合成:在50 mL的圓底燒瓶中一次加入 0.031 9 g 碲粉（0.025 mmol）、0.038 0 g 硼氫化鈉（1 mmol）、5 mL 超純水，通入氮氣，磁力攪拌至變成淡紫色溶液待用。

2）巰基丙酸-鎘配合物的制備:在250 mL的三口燒瓶中一次加入200 mL超純水，0.114 2 g水合氯化鎘（0.5 mmol）、0.109 2 g 巰基丙酸（1.2 mmol），充分溶解后，用1 mol/L NaOH調節(jié)溶液的pH值至11.2，之后通氮氣約30 min。

3）碲化鎘量子點的制備:將已經制備的碲氫化鈉溶液加入至巰基丙酸-鎘配合物溶液中，通氮氣，120℃恒溫攪拌回流計時，取12 h后的樣品，利用透射電鏡表征其形貌，通過熒光分光光度計、紫外可見分光光度計對CdTe發(fā)光量子點光譜性質進行表征。

2.1.2 CdTe量子點與羊抗兔IgG的結合 借鑒Clapp，So等的方法[10-13]并加以改進，制備CdTe量子點與羊抗兔IgG復合物，具體方法為:取200 μL CdTe量子點加入2 mg/mL的EDC 50 μL，室溫下混合5 min，37℃振蕩反應15～20 min，再加入2 mg/mL的 NHS 25 μL，室溫下振蕩反應 15 min，再加入2 mg/mL的羊抗兔 IgG 200 μL，37℃振蕩反應 2 h，6 000 r/min離心15 min，棄去上清液。用PBS清洗一次，同樣條件再次離心去上清液，重懸于100 μL超純水中，以除去未反應的羊抗兔IgG，4℃保存。

2.1.3 氨基化磁性納米粒子的制備 實驗中采用了水熱溶劑法[14-15]制備氨基化Fe3O4磁性納米粒子，以六合水氯化高鐵為鐵源，1，6-己二胺作為氨基功能化試劑，無水醋酸鈉為堿，乙二醇為溶劑和還原劑，通過198℃反應成功制備了氨基化磁性納米粒子，并利用TEM和Dmax-IIIB X-射線衍射儀（XRD）對其形貌和組成進行了表征。

2.1.4 磁性納米粒子與人工抗原AFB1-BSA的結合與表征 10 mg的MNPs（Fe3O4磁性納米顆粒）分散在5 mL的0.01 mol/L的PBS溶液中超聲20 min，加入1.25 mL質量分數25%的戊二醛和100 mg的硼氫化鈉，在室溫下振蕩1 h，通過外部磁場將Fe3O4富集，用PBS緩沖液沖洗除去未完全吸附的戊二醛，溶于5 mL PBS。取2 mg/mL磁性納米粒子 150 μL，加入 50 μL 1.4 mg/mL 的 AFB1-BSA，在室溫下振蕩6 h，通過磁力收集產物，并用PBS清洗3次。用2 mg/mL的BSA溶液200 μL重懸產物，室溫下保存6 h，封閉沒有結合人工抗原的結合位點。磁力收集產物，產物重懸于200 μL超純水中并保存于4℃待用，用熒光倒置顯微鏡和UV2300紫外可見分光光度計對其進行表征。

2.2 實驗條件優(yōu)化

2.2.1 磁性納米粒子與人工抗原（AFB1-BSA）結合的濃度優(yōu)化 磁性納米粒子Fe3O4溶液濃度較大時顏色黑，容易遮蔽熒光強度從而影響測量。將人工抗原分別與質量濃度為1、2、5、10 mg/mL的磁性納米粒子結合。取200 μL結合濃度不同的MNPs-AFB1-BSA，加入200 μL稀釋200倍的AFB1單克隆抗體，37℃下反應2 h，清洗后在體系中加入作者制備的二抗量子點復合物原液200 μL，37℃下反應2 h，清洗后重懸于100 μL超純水中，測定熒光強度并作圖。

2.2.2 羊抗兔IgG與量子點結合濃度的優(yōu)化 在本實驗中發(fā)現(xiàn)碲化鎘量子點納米粒子表面所連接的羊抗兔-IgG的濃度對測定時的熒光強度影響較大。為了研究此影響因素，將熒光納米粒子與不同濃度的羊抗兔-IgG結合，選取質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0 mg/mL 的羊抗兔-IgG 溶液 200 μL，分別加入至1.5 mL的離心管中，用2.1.2節(jié)所述方法將量子點與羊抗兔IgG結合，并加入后續(xù)的反應步驟中，測定最終熒光強度并作圖。

2.2.3 AFB1單克隆抗體的結合濃度優(yōu)化 本實驗中所建立的免疫競爭反應模式是通過結合磁性納米材料上的人工抗原和標準黃曲霉毒素B1競爭結合AFB1單克隆抗體而實現(xiàn)的，因此適宜的AFB1單克隆抗體溶液濃度是本實驗檢測的關鍵。因此對AFB1單克隆抗體的包被液濃度進行了優(yōu)化。分別取相對于 AFB1單克隆抗體原液稀釋了 200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 倍的溶液 200 μL，加入到200 μL Fe3O4磁性納米粒子與人工抗原復合物體系中，37℃反應2 h，加入作者制備的二抗量子點復合物原液，37℃下反應2 h，清洗重懸于100 μL超純水中測定熒光強度并作圖。

2.2.3 QDs-羊抗兔IgG復合物濃度的優(yōu)化 加入AFB1人工抗原功能化磁性納米粒子溶液200 μL至1.5 mL的離心管中，共8管，后加入200 μL稀釋1 000倍的AFB1單克隆抗體，37℃搖床2 h，外加磁力富集，棄去上清液，并用0.01 mol/L的PBS溶液清洗3次，得到沉淀物，取不同稀釋倍數的二抗復合物溶液各200 μL，稀釋倍數分別為原液、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍，分別加入上述離心管搖床內37℃反應2 h。使用外加磁力富集，棄去上清液，沉淀物重懸于100 μL超純水中，測定重懸液的熒光強度并作圖。

2.3 黃曲霉毒素B1的檢測

2.3.1 免疫反應 取磁性納米粒子與AFB1人工抗原復合物 （MNPs-AFB1-BSA）溶液200 μL置于1.5 mL的離心管中，加入標準黃曲霉毒素B1100 μL（空白組中加入 100 μL 超純水），再加入 200 μL稀釋1 000倍的AFB1單克隆抗體，用0.01 mol/L的PBS溶液定容至1.0 mL，37℃恒溫2 h，外加磁力使磁性納米粒子富集，棄去上清液，并用PBS緩沖液沖洗3次，磁富集得到沉淀物，用質量分數2%的BSA溶液孵育以封閉人工抗原剩余結合位點。加入作者中制備的CdTe發(fā)光量子點與羊抗兔IgG的結合物，稀釋2倍后置200 μL的離心管中，用0.01 mol/L的PBS溶液定容至1.0 mL，超聲處理10 min增大磁性納米粒子分散度，3 7℃恒溫靜置2 h。利用外加磁力使納米粒子富集，棄去上清液，沉淀物用100 μL超純水重懸，測定重懸液的熒光強度。

2.3.2 標準曲線 對標準黃曲霉毒素B1進行梯度稀釋，根據2.3.1的實驗步驟，測定最終的熒光強度，作出標準曲線，得出黃曲霉毒素B1與所測熒光強度的線性關系以及最低檢測限。

2.3.3 檢測方法的應用 取市售玉米粉，加入不同濃度的黃曲霉毒素B1，用甲醇水法提取玉米粉中的黃曲霉毒素B1，采用本文方法測定熒光強度。將檢測到的熒光強度代入建立好的線性方程，計算黃曲霉毒素B1含量，和之前加入的量進行比較，計算回收率以評價該方法的準確性。

3 結果與討論

3.1 CdTe量子點的制備與表征

按照實驗方法制備了CdTe發(fā)光量子點，并采用TEM和熒光光譜對其進行表征。由圖1可知，CdTe量子點的粒徑為5 nm左右，呈球形，分散性良好。圖2為反應12 h的CdTe量子點熒光光譜，在360 nm的激發(fā)光下，CdTe量子點的最大發(fā)射波長為560 nm。

圖1 CdTe量子點的透射電鏡圖Fig.1 TEM image of CdTe QDs

圖2 CdTe量子點的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of CdTe QDs

3.2 氨基化磁性納米顆粒的表征

由TEM（圖3）可知，實驗所制備的氨基化磁性納米顆粒粒徑在35～55 nm，由X-衍射（圖4）可知，制備出來的是尖晶石型Fe3O4磁性納米顆粒，峰形符合JCPDS卡82-1533，其窄而強的衍射峰充分說明了磁性納米顆粒具有良好的結晶性[16]。

圖3 Fe3O4納米顆粒的TEM圖Fig.3 TEM image of the prepared Fe3O4nanoparticles

圖4 Fe3O4納米顆粒的XRD圖Fig.4 XRD patterns of the prepared Fe3O4nanoparticles and the standard data for Fe3O4

3.3 磁性納米粒子和人工抗原AFB1-BSA的結合與表征

黃曲霉毒素B1在紫外線照射下產生熒光，與磁性納米粒子相連的AFB1-BSA經過清洗與磁富集，磁珠溶液在熒光顯微鏡下有熒光顯示，如圖5所示。表明磁性納米粒子與AFB1-BSA成功偶聯(lián)。

圖5 MNPs-AFB1-BSA復合物熒光顯微鏡圖（40*100）Fig.5 Fluorescence microscope of MNPs-AFB1-BSA

由圖6所示，在波長280 nm和360 nm處，200 μL人工抗原AFB1-BSA原液紫外吸收和與磁性納米材料結合富集后上清液紫外吸收相比較有一定差值，表明有部分AFB1-BSA已經成功連接到了磁性納米粒子上。

圖6 紫外可見吸收圖譜Fig.6 Ultra-visible（UV）absorption spectrum

3.4 實驗條件優(yōu)化

3.4.1 磁性納米粒子與人工抗原結合的濃度優(yōu)化實驗考察了不同濃度磁性納米粒子Fe3O4溶液與人工抗原結合時系統(tǒng)熒光強度的變化情況。結果發(fā)現(xiàn)（圖 7）， 磁性納米粒子質量濃度為 1、5、10 mg/mL時，熒光強度均低于2 mg/mL的，分析原因可能是磁珠濃度過高時，磁珠的黑色對熒光造成了遮蔽效應。故實驗中選擇2 mg/mL的磁性納米粒子溶液。

圖7 不同質量濃度磁性納米粒子溶液與人工抗原結合熒光強度的關系曲線Fig.7 Fluorescence intensity of different concentration Fe3O4combined with AFB1-BSA

3.4.2 羊抗兔IgG與量子點結合濃度的優(yōu)化 實驗考察了不同濃度羊抗兔IgG與量子點結合時系統(tǒng)熒光強度的變化情況。結果發(fā)現(xiàn)（圖8），羊抗兔IgG 的質量濃度為 0.1、0.5、1、1.5、2、5 mg/mL，測定的熒光強度隨羊抗兔IgG的量的增大而增大；當羊抗兔IgG的質量濃度超過1 mg/mL時，最終熒光強度升高并趨于穩(wěn)定。故實驗選用1 mg/mL的羊抗兔IgG溶液與量子點結合。

圖8 不同質量濃度羊抗兔IgG與量子點結合熒光強度的關系曲線Fig.8 Fluorescence intensity of different concentration goat anti-rabbit IgG coated with QDs

3.4.3 AFB1單克隆抗體的結合濃度優(yōu)化 實驗也考察了AFB1單克隆抗體的結合濃度對系統(tǒng)熒光強度的影響。由圖9可知，AFB1單克隆抗體稀釋10 000、5 000、1 000倍時，熒光強度上升，稀釋倍數小于1 000時熒光強度趨于穩(wěn)定，此時AFB1單克隆抗體趨于飽和，故選擇AFB1稀釋1 000倍作為最佳反應濃度。

圖9 不同質量濃度的AFB1單克隆抗體孵育前后熒光強度差值的關系曲線Fig.9 Fluorescence intensity of monoclonal antibodies incubation of AFB1of different concentration

3.4.4 QDs-羊抗兔IgG濃度的優(yōu)化

實驗進一步考察了QDs-羊抗兔IgG復合物濃度對系統(tǒng)熒光強度的影響。CdTe發(fā)光量子點與1 mg/mL羊抗兔IgG反應后將其復合物稀釋0、2、5、10、50、100倍作為優(yōu)化條件，將橫坐標設定為反應中加入的羊抗兔IgG質量濃度，縱坐標為熒光強度。由圖10可知，復合物原液與稀釋2倍的溶液復合物最終熒光強度較高且比較穩(wěn)定，故本次實驗選擇稀釋2倍的溶液復合物。

圖10 QDs-羊抗兔IgG不同稀釋倍數與熒光強度的關系曲線Fig.10 Fluorescence intensity curve of QDs-goat antirabbit IgG in different concentration

3.5 標準曲線

在實驗選定的最佳條件下，熒光強度與黃曲霉毒素B1質量濃度在0.1～100 ng/mL范圍內呈良好的線性關系（圖11），線性方程為IF=-1 333.35[AFB1]+267 752（R2=0.996 8），檢出限為 0.1 ng/mL。7 次測量50 ng/mL標準黃曲霉毒素B1以評估該方法的精密度，相對標準偏差為3.0%。

圖11 黃曲霉毒素B1質量濃度與熒光強度的關系曲線Fig.11 Standard curve for AFB1 and fluorescence intensity

3.6 玉米樣品中黃曲霉毒素B1的檢測

按照實驗部分所述，實驗中考察了所建立的方法，由表1可知，玉米粉樣品中黃曲霉毒素B1的加標回收率為88.0%～98.8%，表明本實驗所建立的新型檢測技術的準確性高，可以用于實際樣品中黃曲霉毒素B1的檢測。

表1 玉米粉樣品中黃曲霉毒素B1的檢測回收率Table 1 Recovery rate of AFB，in compowder samples

4 結語

基于生物功能化磁性納米粒子的有效分離富集、發(fā)光量子點的高效熒光標記，結合競爭免疫分析技術，成功建立了黃曲霉毒素B1的新型檢測方法。首先在水相中合成CdTe發(fā)光量子點，并采用水熱法合成了磁性納米粒子，以AFB1人工抗原功能化磁性納米粒子作為捕獲探針，以發(fā)光量子點標記羊抗兔IgG作為信號探針，基于競爭免疫原理，建立了AFB1的新型檢測方法。實驗優(yōu)化條件下，熒光強度與AFB1質量濃度在0.1～100 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，檢測限為0.03 ng/mL。同時通過檢測玉米中AFB1的情況來評價該方法的準確性，顯示了該法良好的應用前景。

[1]Bruchez Jr M，Moronne M，Gin P，et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science，1998，281（5385）:2013-2016.

[2]Murray C B，Norris D J，Bawendi M G.Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE（E=sulfur，selenium，tellurium）semiconductor nano-crystallite[J].J Am Chen Soc，1993.115（19）:8706-8715.

[3]Peng Z A，Peng X G.Formation of high-quality CdTe，CdSe and CdS nanocrystals using CdO as precursor[J].J Am Chem Soc，2001，123（1）:183-184.

[4]Rajh T，Micic O I，Nozik A J.Synthesis and characteristics of surface-modified colloidal CdTe quantum dots[J].The Journal of Physical Chemistry，1993，97（46）:11999-12003.

[5]Wu X，Wu H，Hu J，et al.Immunofluorescent Labeling of cancer marker and other cellular targets with semiconductor quantum dots[J].Nat Biotechnol，2003，21（1）:41-46.

[6]Medintz I L，Trammell S A，Mattoussi H，et al.Reversible modulation of quantum dot photoluminescence using a protein-bound photochromic fluorescence resonance energy tranfer aceeptor[J].J Am Chem Soc，2004，126（1）:30-31.

[7]Zhang C Y，Yeh H C，Kuroki M T，et al.Single-Quantum-Dot-Based DNA nanosensor[J].Nature Materials，2005，4（11）:826-831.

[8]李太山，劉紹璞，劉忠芳，等.CdTe納米晶溶液的熒光和共振瑞利散射特性及CdTe納米晶與氨基糖苷類抗生素相互作用[J].中國科學 B，2008，38（9）:798-807.LI Tai-shan，LIU Shao-pu，LIU Zhong-fang，et al.Properties of fluorescence and Resonance rayleigh scatlering of CdTe nanocrystals and interaction between CdTe nanocrystals and Aminoglycosides[J].Scientia Sinica B，2008，38 （9）:798-807.（in Chinese）

[9]Zhang H，Zhou Z，Yang B，et al.The influence of carboxyl groups on the photoluminescence of mercaptocarboxylic acidstabilized CdTe nanoparticles[J].J Phys Chem B，2003，107（1）:8-13.

[10]Hua X F，Liu T C，Cao Y C，et al.Characterization of the coupling of quantum dots and immunoglobulin antibodies[J].Anal Bioanal Chem，2006，386（6）:1665-1671.

[11]Xing Y，Chaudry Q，Shen C，et al.Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry[J].Nat Protoc，2007，2（5）:1152-1165.

[12]Clapp A R，Goldman E R，Mattoussi H.Capping of CdSe-ZnS quantum dots with DHLA and subsequent conjugation with proteins[J].Nat Protoc，2006，1（3）:1258-1266.

[13]So M K，Loening A M，Gambhir S S，et al.Creating self-illuminating quantum dot conjugates[J].Nat Proto，2006，1 （3）:1160-1164.

[14]Deng H，Li XL，Peng Q，et al.Monodisperse magnetic single-crystal ferrite microspheres[J].Angew Chem Int Edit，2005，44:2782-2785.

[15]Wang L Y，Bao J，Wang L，et al.One pot synthesis and bioapplication of amine-functionalized magnetite nanoparticles and hollow nanospheres[J].Chem Eur，2006，12:6341-6347.

[16]李民勤，徐慧顯，何炳林.葡萄糖磁性豪微粒的制備[J].高等學?；瘜W學報，1996，17:147-150.LI Min-qin，XU Hui-xian，HE Bing-lin.Preparation of glucose magnetic nanosomes[J].Chemical Journal of Chinese University，1996，17:147-150.（in Chinese）