付海田， 徐靜靜， 鄧 超， 胡明華， 徐曉飛， 陳敬華*

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623）

作為主要的供能途徑，氧化反應(yīng)在生物體的生存過程中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。但活性氧（ROS）會(huì)對(duì)DNA造成損傷，從而引起癌癥、冠心病以及其他老年性疾病[3-4]，不受機(jī)體控制產(chǎn)生過多的氧自由基會(huì)加快機(jī)體衰老，同時(shí)可能會(huì)引發(fā)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[5]。而人工合成的抗氧化劑的安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然抗氧化劑[6]。因此，尋找一種天然的、有效的、無毒性、安全的抗氧化劑來消除體內(nèi)自由基[7]成為當(dāng)今醫(yī)藥界關(guān)注的課題。

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體或發(fā)酵液中分離出來的一類具有生物活性的大分子碳水化合物。研究表明，真菌多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血壓、降血脂等生理功效，并且對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生毒副作用[8-9]，因此可作為潛在的機(jī)體抗氧化劑加以開發(fā)。目前關(guān)于多糖抗氧化的研究主要局限在單一多糖的層面上，而關(guān)于復(fù)合多糖的研究還較少。作者研究一種以香菇、竹蓀和蟲草菌粉為主要成分的真菌保健口服液中的復(fù)合多糖的提取及體外抗氧化活性，旨在為中藥有效成分的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

保健液口服液、香菇、竹蓀、蟲草菌粉，均由廣州無限極（中國）有限公司提供；鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、溴化鉀、水楊酸、三氯乙酸、三氯化鐵、雙氧水、DPPH等，均為國產(chǎn)分析純；透析袋，購自上海捷瑞生物工程有限公司；SephadexG-200，購自上海鵬順科學(xué)儀器有限公司。

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司制造；NICOLET NEXUS 470型紅外光譜儀，Thermo Electron Corporation制造；FreeZone 2.5 L冷凍干燥機(jī)，美國Labconco有限公司制造；LC1200型凝膠滲透層析液相色譜儀，安捷倫科技有限公司制造。

1.2 復(fù)合多糖的提取

口服液中的復(fù)合多糖提取采取直接用乙醇沉淀（口服液體積∶乙醇體積=1∶4），獲得的粗多糖沉淀水溶后，采用sevage法脫蛋白，將混合液（正丁醇體積∶氯仿體積=1∶4）等體積加入糖溶液中后，劇烈振搖20～30 min，靜置至溶液分層，將溶劑層和溶液層中間變性蛋白質(zhì)去掉，重復(fù)多次，直至無中間蛋白層出現(xiàn)。將脫蛋白質(zhì)后的糖溶液pH調(diào)至8.0左右，55℃下滴加體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫，保溫2 h至淡黃色后，將多糖溶液醇沉復(fù)溶后，透析去除鹽類等小分子物質(zhì)[10-11]，經(jīng)G200型凝膠色譜柱純化后，用苯酚-硫酸法檢測洗脫曲線為單一對(duì)稱峰（圖1），證明為單一成分，經(jīng)GPC檢測該復(fù)合多糖重均分子量為2.4*105。洗脫液冷凍干燥得復(fù)合真菌多糖樣品。

圖1 口服液多糖組分的Sephadex G200型凝膠過濾色譜圖Fig.1 Sephadex G -200 chromatogram of the polysaccharide extracted from the Healthy oral liquid shows a large peak near aliquot 35

1.3 單糖分析

1.3.1 多糖水解 稱取20 mg左右多糖于水解管中，加入2 mL 1 mol/L的硫酸水溶液，封管，于100℃水解4 h，水解液用碳酸鋇中和，過濾，濾液冷凍干燥或置真空烘箱在45℃下真空干燥，得到的干燥物即為游離單糖。

1.3.2 衍生化 稱取上述干燥單糖樣品加入10 mg鹽酸羥胺，加入2 mg肌醇作為內(nèi)標(biāo)，0.5 mL吡啶，于90℃水浴中保持30 min；取出冷卻后加入0.5 mL乙酸酐于90℃水浴中保持30 min，待樣品冷卻后進(jìn)行GC分析。

1.3.3 色譜分析條件 島津GC-14A氣相色譜儀；OV1701 石英毛細(xì)管柱（30 m，0.53 mm，1.0 μm）；檢測器為FID（氫火焰離子鑒定器）。

1.3.4 氣相條件 氣化室溫度260℃，檢測器溫度250℃；柱溫升溫程序:起始溫度120℃，保持3 min，每分鐘升10℃，至195℃，保留0.1 min，每分鐘升3℃，至240℃，保留10 min；載氣壓力（N2）0.60 kg/cm2，燃?xì)鈮毫Γ℉2）:0.65 kg/cm2，助燃?xì)鈮毫Γ諝猓?.50 kg/cm2，分流比 30∶1，進(jìn)樣量 2.0 μL。

1.4 紅外圖譜分析

溴化鉀壓片法:室溫條件下，將1 mg干燥的樣品與適量干燥溴化鉀混合研磨壓片后，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描并FTIR分析。

1.5 體外抗氧化活性

1.5.1 系列多糖樣品溶液的配制 分別稱取適量所得真菌復(fù)合多糖及其3種組分多糖 （香菇多糖、竹蓀多糖和蟲草多糖），用去離子水溶解配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的溶液，再分別吸取該母液2.5、1.5、0.5、0.25 mL 至試管中， 加水補(bǔ)至 5 mL，即得質(zhì)量濃度為 500、300、100、50 μg/mL 的樣品溶液。

1.5.2 還原力測定 在具塞試管中加入1 mL多糖樣品（50～1 000 μg/mL）、0.2 mL PBS（2.0 mol/L，pH 6.6）和0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液。置50℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，迅速冷卻，再加入10 g/dL的三氯乙酸溶液0.5 mL，3 000 g離心10 min，取上清液1.5 mL，加入0.1 mL 1 g/dL三氯化鐵溶液和3.0 mL去離子水，振蕩均勻，靜置5 min，在700 nm處以蒸餾水代替多糖溶液為空白，測定其吸光值[12]。

1.5.3 對(duì)羥基自由基的清除 在試管中依次加入1 mL 不同質(zhì)量濃度的多糖樣品 （50～1 000 μg/mL），0.9 mL FeSO4（0.15 mmol/L），0.5 mL 水 楊 酸 （9 mmol/L），0.5 mL H2O2（8.8 mmol/L），37 ℃反應(yīng) 60 min，于510 nm處測得不同竹蓀多糖濃度下的吸光值A(chǔ)x，水楊酸替代雙氧水時(shí)的吸光值A(chǔ)x0，水楊酸代替多糖測得空白對(duì)照吸光值A(chǔ)0[13]。

·OH 清除率=[A0-（Ax-Ax0）/A0]×100%

1.5.4 對(duì)DPPH自由基的清除 樣品管中加入1 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液 （50～1 000 μg/mL）與3.0 mL的0.004%體積分?jǐn)?shù)溶于95%乙醇的DPPH溶液，室溫放置10 min后，517 nm處測定吸光值A(chǔ)x，空白管用蒸餾水代替多糖溶液，測定值為A0，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替DPPH測定值為Ax0[14]。

DPPH 自由基清除率=[1-（Ax-Ax0）/A0]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖組成

通過對(duì)各多糖的單糖組成摩爾比進(jìn)行比較（見表1），可得出該復(fù)合多糖中主要成分為蟲草多糖，竹蓀多糖和香菇多糖含量極少，即該保健口服液中大部分原材料為成本較低的蟲草菌粉。

2.2 紅外分析

真菌復(fù)合多糖的特征吸收峰、紅外光譜譜圖見圖2，表現(xiàn)出一般多糖的特征吸收峰:由多糖羥基的伸縮振動(dòng)引起的3 600?～3 200 cm-1之間的吸收峰、由C—H伸縮振動(dòng)引起的2 930 cm-1處的吸收峰等特征峰[10]。此外840 cm-1處無吸收峰，890 cm-1處有明顯吸收峰，表明該復(fù)合多糖是以β糖苷鍵相連的。

表1 各多糖單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of polysaccharides

圖2 復(fù)合多糖紅外色譜圖Fig.2 FTIR spectrum of the combined fungus polysaccharide

2.3 還原力測定

鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]可被還原試劑還原成亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再和 Fe3+作用生成普魯士藍(lán)，在700 nm處有最大吸收值，以檢測其還原力，吸光值越大，說明其還原力越高[15]。

隨著多糖質(zhì)量濃度的增加（圖3），各多糖還原能力呈現(xiàn)出穩(wěn)定的增長，復(fù)合多糖的還原能力在各質(zhì)量濃度測量范圍內(nèi)均大于竹蓀多糖和蟲草多糖。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為50、100 μg/mL時(shí)，復(fù)合多糖與香菇多糖的還原能力無明顯差異，而在較大質(zhì)量濃度時(shí)復(fù)合多糖還原能力小于香菇多糖。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，各多糖還原能力達(dá)到最大，其中復(fù)合多糖OD700為0.478，香菇多糖為0.667。

2.4 對(duì)羥自由基清除能力測定

利用H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)[16]，生成具有很高反應(yīng)活性的·OH，在該體系內(nèi)加入水楊酸可捕捉·OH并產(chǎn)生深色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。

隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，各多糖對(duì)羥基自由基清除能力呈現(xiàn)出穩(wěn)定的增長（圖4），復(fù)合多糖的清除能力在各質(zhì)量濃度測量范圍內(nèi)均大于竹蓀多糖和蟲草多糖，小于香菇多糖的清除能力。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，各多糖對(duì)羥基的清除能力達(dá)到最大，其中復(fù)合多糖清除率為44.26%，香菇多糖清除率為61.76%，蟲草多糖清除率為32.41%，竹蓀多糖清除率為26.85%。

圖3 還原力曲線Fig.3 Curve of reducing power

圖4 真菌多糖對(duì)羥自由基的清除能力Fig.4 Effects of polysaccharides on scavenging·OH

2.5 對(duì)DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在可見光區(qū)517 nm處有最大吸收峰，抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)，DPPH溶液變色的程度反映了提取物的清除能力。這一反應(yīng)已被廣泛用于測試化合物自由基清除能力和評(píng)價(jià)食品、植物提取物的抗氧化活性。

由圖5可看出，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，只有香菇多糖對(duì)DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出逐漸增長的趨勢(shì)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為50～300 μg/mL范圍內(nèi)，蟲草多糖對(duì)DPPH自由基清除能力幾乎未發(fā)生改變，竹蓀多糖的清除能力出現(xiàn)降低趨勢(shì)，但小于復(fù)合多糖以及香菇多糖的清除能力；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為500、1 000 μg/mL時(shí)，復(fù)合多糖、蟲草多糖以及竹蓀多糖DPPH自由基清除能力逐漸上升，并在多糖質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)達(dá)到最大，復(fù)合多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為12.09%，蟲草多糖為6.04%，竹蓀多糖為4.95%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于香菇多糖的49.95%。

圖5 真菌多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 Effects of polysaccharides on scavenging DPPH·

3 結(jié)語

各真菌多糖抗氧化活性在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均隨著多糖質(zhì)量濃度的增加顯示出穩(wěn)定的增長，且從保健口服液中提取出來并純化后的真菌復(fù)合多糖的抗氧化活性高于竹蓀多糖及蟲草多糖，但較香菇多糖的活性低或相當(dāng)。從抗氧化活性來講，該保健口服液中含有的真菌復(fù)合多糖比單一使用竹蓀或者蟲草菌粉為原料的活性高，比公認(rèn)高活性的香菇多糖低，但是以香菇為單一原料制作口服液的成本較高，因此，同時(shí)考慮活性和成本時(shí)，該保健口服液具有更高的抗氧化活性。

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