丁威利,隋愛華,劉世海,劉相萍,王靜,王海波

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺中心,山東青島 266003)

大氣壓冷等離子體射流誘導(dǎo)乳癌細(xì)胞凋亡研究

丁威利,隋愛華,劉世海,劉相萍,王靜,王海波

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺中心,山東青島 266003)

目的研究大氣壓冷等離子體射流對乳癌細(xì)胞系MDA-MB-468細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。方法采用自行研制的大氣壓冷等離子體射流發(fā)生裝置,處理MDA-MB-468細(xì)胞。大氣壓冷等離子體射流處理時間分別為10、30、60和90 s,以不處理者為空白對照組,以單純氣流處理90 s者為實(shí)驗(yàn)對照組。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率,二脒基苯基吲哚(DAPI)染色檢測各組細(xì)胞的核形態(tài)變化,熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)測定各組細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果大氣壓冷等離子體射流可明顯抑制細(xì)胞的增殖,且有明顯的劑量依賴性(F＝22.4、42.3,P＜0.01),而單純氣流對MDA-MB-468細(xì)胞無明顯影響。經(jīng)大氣壓冷等離子體射流處理后細(xì)胞出現(xiàn)核固縮及核碎裂。大氣壓冷等離子體射流作用后細(xì)胞Bax的表達(dá)上調(diào),Bcl-2的表達(dá)下調(diào)(F＝32.3、12.4,P＜0.05)。結(jié)論大氣壓冷等離子體射流對MDA-MB-468細(xì)胞有增殖抑制作用,可能與Bax表達(dá)上調(diào)及Bcl-2表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

大氣壓冷等離子體射流;乳腺腫瘤;細(xì)胞凋亡;基因,bcl-2;bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)

目前乳癌治療的主要方式有手術(shù)、放療、化療以及生物靶向治療等。這些治療方式在治療疾病的同時會給病人帶來新的創(chuàng)傷與副作用,創(chuàng)傷副作用小的治療方式依然處于探索階段。大氣壓冷等離子體由于具有高效且作用溫度低的特點(diǎn),逐漸在生物學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用,尤其近年來在癌癥治療的基礎(chǔ)研究方面逐漸為人們所重視[1-2]。大氣壓冷等離子體射流是由電離氣流產(chǎn)生,射流作用在人體不會造成明顯的疼痛感,對人體的遠(yuǎn)期不良影響也未見報道。本文主要研究大氣壓冷等離子體射流對乳癌細(xì)胞增殖的抑制作用,并初步探討其誘導(dǎo)乳癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,為其應(yīng)用于乳癌治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳癌細(xì)胞系(MDA-MB-468),購自上海細(xì)胞庫。L-15培養(yǎng)液及四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑購自美國Sigma公司,胰蛋白酶購自Amresco公司,胎牛血清購自Hyolone公司,Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)試劑盒均購自TAKARA公司。

1.2 大氣壓冷等離子體射流裝置結(jié)構(gòu)

大氣壓冷等離子體射流裝置結(jié)構(gòu)見圖1。放電管由單層陶瓷管構(gòu)成,陶瓷管長60 mm,內(nèi)、外徑分別為3、6 mm。陶瓷管軸心位置置入長30 mm、直徑1 mm的銅電極,銅電極上端接電源高壓端,下端在陶瓷管內(nèi),距離陶瓷管下端口15 mm。在陶瓷管下部端口處,纏繞接地銅線電極。放電電源(南京蘇曼電子有限公司,CTP 200K)的中心頻率為35 k Hz,可調(diào)頻率范圍為20～45 k Hz,最大輸出電壓為30 k V,最大輸出功率為500 W。放電電壓由Tektronix P6015A高壓探頭測量,探頭輸出電壓饋入Tektronix 3052B數(shù)字熒光示波器。氬氣、氧氣由陶瓷管上部饋入,純度分別為99.5%、99.995%。氣體流量由氣體浮子流量計(大連通產(chǎn)儀表有限公司, TCG 800)測量,氬氣、氧氣的標(biāo)定流量量程分別為200、4 L/h。大氣壓冷等離子體射流的放電處理參數(shù)如下:電源電壓6 k V,頻率30 k Hz,氬氣與氧氣的流量分別為2 L/min與0.02 L/min。噴嘴和96孔板的距離為10 mm。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

MDA-MB-468細(xì)胞生長于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2孵箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞生長情況,定期換液。細(xì)胞長成單層后,以2.5 g/L胰蛋白酶＋0.2 g/ L的EDTA消化傳代。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

實(shí)驗(yàn)共分為6個組?？瞻讓φ战M(不處理)、實(shí)驗(yàn)對照組(單純氣流處理90 s)、實(shí)驗(yàn)1組(大氣壓冷等離子體射流處理10 s)、實(shí)驗(yàn)2組(大氣壓冷等離子體射流處理30 s)、實(shí)驗(yàn)3組(大氣壓冷等離子體射流處理60 s)、實(shí)驗(yàn)4組(大氣壓冷等離子體射流處理90 s)。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的MDA-MB-468細(xì)胞,每孔接種10 000個細(xì)胞于96孔板上,設(shè)6個復(fù)孔。24 h后將孔內(nèi)培養(yǎng)液換成40μL PBS,分組對細(xì)胞進(jìn)行處理。待等離子體處理結(jié)束后離心96孔板并將PBS吸出換成新鮮培養(yǎng)液。每孔分別于處理結(jié)束24、48 h后,加入5 g/L MTT 10μL,繼續(xù)孵育4 h,小心棄掉上清液,每孔加入DMSO 150μL,在振蕩器上振蕩10 min后,酶標(biāo)分析儀檢測波長490 nm處的吸光度(A)值。計算細(xì)胞增殖抑制率,細(xì)胞增殖抑制率(%)＝(對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%。

1.6 二脒基苯基吲哚(DAPI)染色

同上方法分組處理細(xì)胞。照射結(jié)束48 h后終止培養(yǎng),離心去上清液后立即用預(yù)冷的甲醇固定, PBS液沖洗并離心后棄去上清液,滴加DAPI染液,－20℃避光孵育15 min,PBS液沖洗3次。每孔樣品隨機(jī)選取視野,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 FQ-PCR檢測Bax和Bcl-2的表達(dá)

同上方法分組處理細(xì)胞。照射結(jié)束48 h后終止培養(yǎng),使用Trizol試劑提取總RNA,紫外線分光光度計測定波長260、280 nm處的A值,計算A260/ A280。取1μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)總體積20μL;取2μL cDNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性30 s;95℃5 s、60℃30 s,40個循環(huán); 95℃1 min,40℃1 min,60℃15 s。擴(kuò)增完后進(jìn)行融解曲線分析,觀察結(jié)果并用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果。PCR反應(yīng)曲線得到CT值,采用2－△△CT方法計算相對定量結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖抑制率隨照射時間延長而增高,均明顯高于實(shí)驗(yàn)對照組和空白對照組(F＝22.4、42.3,P＜0.01),而實(shí)驗(yàn)對照組與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。同時各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率也隨照射后培養(yǎng)時間延長而增高(t＝3.2～30.1,P＜0.01)。見表2。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

在空白對照組與實(shí)驗(yàn)對照組細(xì)胞中可偶見核分裂象,但未見明顯的核固縮,而各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞中均可見明顯核固縮及核碎裂,碎裂的細(xì)胞核呈亮藍(lán)色熒光。隨照射時間延長,細(xì)胞發(fā)生核固縮及核碎裂的細(xì)胞比例有增高的趨勢。見圖2。

2.3 FQ-PCR檢測

提取各組的總RNA,檢測其A260/A280比值均在1.8～2.0范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)2、4組Bax和Bcl-2的表達(dá)與實(shí)驗(yàn)對照組和空白對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(F＝32.3、12.4,P＜0.01),而實(shí)驗(yàn)對照組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表2 大氣壓冷等離子體射流對MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率的影響(n＝6,χ/%,±s)

____組__別____________________________________________________ ___________24 h 48 h空白對照組0.33±0.95 0.53±0.38實(shí)驗(yàn)對照組1.41±1.34 3.66±9.66實(shí)驗(yàn)1組9.65±2.31 14.72±3.12實(shí)驗(yàn)2組15.70±1.49 36.31±3.10實(shí)驗(yàn)3組21.74±2.26 53.27±1.76 __實(shí)驗(yàn)4組______29.29±1.87______________________________ ___57.21±1.28

表3 各組MDA-MB-468細(xì)胞中Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)比較(n＝6,±s)

____組__別_____________Bax Bcl-2空白對照組1 1實(shí)驗(yàn)對照組1.003±0.176 1.010±0.044實(shí)驗(yàn)2組1.385±0.196 0.807±0.058 __實(shí)驗(yàn)4組______1.736±0.003______________________________ _0.731±0.066

3 討 論

現(xiàn)有的腫瘤治療方式不可避免會給病人帶來新的創(chuàng)傷與副作用,目前還沒有更好的治療選擇。大氣壓冷等離子體射流裝置產(chǎn)生的射流溫度低,人手指觸及射流僅可感覺到輕微氣體吹動,沒有任何熱或電擊等不適感。一些基礎(chǔ)研究認(rèn)為大氣壓冷等離子體射流可能成為一種新的癌癥治療方式,其遠(yuǎn)期不良影響未見報道[2]。

目前的研究已表明,大氣壓冷等離子體射流對Hep G2、He La等細(xì)胞有滅活作用,其滅活機(jī)制與細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。但在乳癌細(xì)胞中滅活機(jī)制研究未見報道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在體外條件下,電離單純氣流形成的大氣壓冷等離子體射流對MDA-MB-468細(xì)胞具有抗增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,并且隨著照射時間的增加,其抑制作用也增強(qiáng),而單純氣流對MDA-MB-468細(xì)胞無明顯影響。這為等離子體的生物應(yīng)用研究開辟了新的思路。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因調(diào)控的一種自主有序的死亡過程。許多生物及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時都伴有腫瘤細(xì)胞Bcl-2和Bax基因表達(dá)水平的改變,Bcl-2和Bax是一組與凋亡相關(guān)的拮抗基因[4]。促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的蛋白在生理情況下維持動態(tài)平衡。但該平衡可能會在細(xì)胞受到有效刺激時被打破,從而影響細(xì)胞凋亡。本研究的DAPI染色結(jié)果顯示,大氣壓冷等離子體射流能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而單純氣流則無凋亡誘導(dǎo)作用。FQ-PCR結(jié)果表明,大氣壓冷等離子體射流可誘導(dǎo)乳癌細(xì)胞凋亡,而Bax與Bcl-2基因可能是其起主要作用的靶點(diǎn)。

目前有研究證實(shí),大氣壓冷等離子體射流還具有滅菌消毒、促進(jìn)切口愈合、止血的作用[5-7]。這將為現(xiàn)有臨床治療過程中可能出現(xiàn)的切口感染、術(shù)中出血等問題提供新的解決方式。同時,許多新型的等離子體裝置正在不斷地改進(jìn)結(jié)構(gòu)及功能,以適應(yīng)在臨床上的應(yīng)用。但是這些研究多著重于研究新型的等離子體裝置,處理對象多是細(xì)菌、化學(xué)材料等,而且國內(nèi)外對等離子體生物學(xué)方面的研究多是從等離子體產(chǎn)生角度著手,如采用不同氣體、不同放電方式或不同的電源等物理角度推理和驗(yàn)證其生物機(jī)制,而且觀點(diǎn)不一。對等離子體抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制的系統(tǒng)研究幾乎是空白。

綜上所述,大氣壓冷等離子體射流有望成為臨床治療乳癌的一種新的技術(shù)手段,但這項(xiàng)技術(shù)距真正應(yīng)用于臨床還有大量工作有待完成。

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(本文編輯 馬偉平)

STUDY ON APOPTOSIS OF BREAST CANCER CELLS INDUCED BY COLD ATMOSPHERIC-PRESSURE PLASMA JET

DING Weili,SUI Aihua,LIU Shihai,LIU Xiangping,WANG Jing,WANG Haibo (Center of Diagnosis and Treatment of Breast Disease,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo study the effect of cold atmospheric-pressure plasma jet(CAPPJ)on apoptosis of MDA-MB-468 cells in breast cancer cell lines.MethodsA self-made CAPPJ device was applied in this study for MDA-MB-468 cells.The cells were exposed to CAPPJ for 10,30 and 90 seconds,respectively.That with no treatment served as blank-control group,that exposed to air stream only for 90 seconds served as experimental-control group.By using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay,the cell proliferation-inhibiting rate in each group was determined;by using DAPI dyeing,the morphologic changes of cell nucleus in each group were detected.The m RNA expressions of Bax and Bcl-2 were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction(Real-time PCR).ResultsCAPPJ could obviously inhibit the cell proliferation with dose-dependent in nature (F＝22.4,42.3;P＜0.01),and air stream only did not impact MDA-MB-468 cells.After exposing to CAPPJ,pyknosis and nuclear fragmentation occurred,Bax expression up-regulated,and Bcl-2 down-regulated(F＝32.3,12.4;P＜0.05).ConclusionThe CAPPJ can inhibit the growth of MDA-MB-468 cells through inducing apoptosis.The mechanism may be associated with promotion of Bax and inhibition of Bcl-2 gene.

cold atmospheric-pressure plasma jet;breast neoplasms;apoptosis;genes,bcl-2;bcl-2-associated X protein

R737.9

A

1008-0341(2013)04-0305-04

10.11712/qlyx201304008

2013-03-14;

2013-06-06

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2008C48)、山東省教育廳基金項(xiàng)目(J11LF65)

丁威利(1986-),男,碩士研究生。

王海波(1966-),男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師。