侯樹(shù)剛,孫瑛,劉麗君,周暢,張晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東青島 266003)

白三烯A4水解酶基因多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)性

侯樹(shù)剛,孫瑛,劉麗君,周暢,張晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東青島 266003)

目的探討白三烯A4水解酶(LTA4H)基因多態(tài)性與缺血性腦卒中(IS)的關(guān)系。方法采用病例-對(duì)照研究、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法,檢測(cè)380例IS病人和290例健康體檢者(對(duì)照組)LTA4H-rs2660845位點(diǎn)的基因多態(tài)性。結(jié)果與對(duì)照組比較,IS組及其亞組的LTA4H-rs2660845基因型(AA、AG、GG)與等位基因(A、G)的分布頻率差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。結(jié)論LTA4H-rs2660845基因多態(tài)性可能與IS的發(fā)病無(wú)關(guān)。

白三烯A4;腦血管意外;多態(tài)性,限制性片段長(zhǎng)度

缺血性腦卒中(IS)具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率等特點(diǎn)。動(dòng)脈粥樣硬化是IS發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的重要病理和生理基礎(chǔ)。炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化的主要致病機(jī)制。白三烯(LTs)是一種重要的炎癥遞質(zhì),它能夠激活白細(xì)胞,促進(jìn)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附,增加血管的通透性;并且還能促進(jìn)動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移[1]。白三烯A4水解酶(LTA4 H)是LTs產(chǎn)生通路的重要的調(diào)節(jié)點(diǎn),也是白三烯B4(LTB4)合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶[2]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,LTA4 H基因多態(tài)性與哮喘、腫瘤、冠心病的發(fā)病相關(guān)[3]。本研究旨在探討LTA4 H基因多態(tài)性與IS的相關(guān)性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及分組

1.1.1 病例組 2010年8月—2012年6月,選取在我科住院的IS病人380例,男248例,女132例;年齡46～82歲,平均(65.42±9.02)歲。均符合1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆腦血管會(huì)議制訂的各類腦血管疾病診斷要點(diǎn),經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)檢查及CT或MRI檢查確診。排除因腦出血、蛛網(wǎng)膜下隙出血或血管炎性疾病等導(dǎo)致的腦梗死,因腦血管淀粉樣變性、惡性腫瘤、血液病、血管畸形或動(dòng)脈瘤等所引起的IS。病人入院后完善各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查,并行經(jīng)顱多普勒超聲(TCD)、頸部血管超聲、CT血管造影(CTA)或磁共振血管成像(MRA)[4]等血管相關(guān)檢查。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的副主任醫(yī)師根據(jù)病人臨床癥狀、體征及各項(xiàng)檢查結(jié)果行TOAST分型,其中大動(dòng)脈粥樣硬化型(LAA)308例,小動(dòng)脈閉塞型(SVD)72例。其余類型不包括在此研究范圍內(nèi)。所選取的研究對(duì)象均有完整的臨床資料,并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 對(duì)照組 290例,為同期我院體檢中心查體健康者,男189例,女101例;年齡55～76歲,平均(65.07±8.46)歲。經(jīng)詳細(xì)的病史詢問(wèn)及系統(tǒng)的體格檢查后,排除腦血管病史及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

兩組性別、年齡、低密度脂蛋白(LDL)比較,差異無(wú)顯著性(P＞0.05);吸煙、高血壓、糖尿病例數(shù)及HDL水平比較,差異均有顯著意義(χ2＝6.322～36.732,t＝－2.143,P＜0.05)。見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集及DNA提取 收集待檢者清晨空腹靜脈血4 m L,置EDTA抗凝管中,應(yīng)用DNA提取試劑盒(Promega公司生產(chǎn))提取DNA,核酸分析儀測(cè)定DNA濃度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)LTA4 H-rs2660845位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的已知序列設(shè)計(jì)PCR引物,并由上海桑尼生物科技有限公司合成引物。引物序列見(jiàn)表2。

1.2.3 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系10μL,內(nèi)含:DNA模板1μL,Taq PCR Master Mix 5μL,上、下游引物各0.2μL,滅菌蒸餾水3.6μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃45 s;59℃45 s,72℃45 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.2.4 酶切反應(yīng) 體系為10μL,內(nèi)含Bsh1236Ⅰ限制性內(nèi)切酶0.3μL,Buffer 1μL,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3μL,滅菌蒸餾水5.7μL。置于37℃溫箱內(nèi)14 h進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)40 g/L瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定樣本基因型。選取部分樣本進(jìn)行測(cè)序以確定酶切結(jié)果是否穩(wěn)定可靠。酶切片段長(zhǎng)度及基因分型見(jiàn)表2。

表1 兩組臨床資料比較(例(χ/%),±s)

___組別_____n______年齡(歲)_______男性________吸煙_______高血壓糖尿病HD(c/mmol·L－1)LD(c/mmol·L－1)對(duì)照組290 65.07±8.46 189(65.2)84(29.0)136(46.9)62(12.8)1.30±0.32 2.66±0.70 __病例組___380___65.42±9.02____248(65.3)__136(35.8)__225(59.2)__117(30.8)______________________________________________ 1.26±0.31 2.81±0.76

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料結(jié)果以±s表示,數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn);相關(guān)分析采用多因素Logistic回歸分析。應(yīng)用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)兩組基因頻率是否符合遺傳平衡定律。

2 結(jié) 果

PCR擴(kuò)增LTA4 H-rs2660845基因位點(diǎn)產(chǎn)物長(zhǎng)度為125 bp,被限制性內(nèi)切酶Bsh1236Ⅰ酶切成3種帶型,分別代表GG、AG、AA基因型(圖1)。

Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)顯示所選群體具有人群代表性(χ2＝0.191,P＞0.05)。病例組和對(duì)照組相比較,LTA4H-rs2660845位點(diǎn)AA、AG、GG基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), A、G等位基因分布差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)。LAA組、SVD組與對(duì)照組比較,AA、AG、GG基因型分布差異無(wú)顯著性(P＞0.05),其等位基因A、G分布差異亦無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

多因素Logistic回歸分析去除高血壓、糖尿病、吸煙、HDL-C的影響后,病例組和對(duì)照組LTA4H-rs2660845位點(diǎn)基因型AA、AG、GG分布差異無(wú)顯著性(P＞0.05),等位基因A、G分布差異無(wú)顯著性(P＞0.05))。LAA組、SVD組與對(duì)照組比較,基因型AA、AG、GG分布以及等位基因A、G分布差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。

3 討 論

已有研究結(jié)果顯示,LTA4 H位于細(xì)胞漿中,其相對(duì)分子質(zhì)量約為69 285,具有氨基肽酶和水解酶的雙重活性,水解酶抑制劑可以抑制其活性[5]。LTA4H是LTB4合成的限速酶,LTA4既能轉(zhuǎn)化成具有致炎作用的LTB4,也能轉(zhuǎn)化成具有支氣管和血管收縮作用以及致炎作用的半胱氨酸白三烯(Cys LTs),即LTC4、LTD4和LTE4。Cys LTs能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)動(dòng)脈管壁白細(xì)胞的聚集,導(dǎo)致血管重塑和血栓形成[6]。已有動(dòng)物研究結(jié)果顯示,大鼠局灶性腦缺血后Cys LTs含量有所增加,Cys LTs的釋放可以被FLAP抑制劑所抑制,從而減小腦梗死體積[7]。由此可見(jiàn),Cys LTs參與了某些炎癥反應(yīng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進(jìn)程。

LTA4 H是由LTA4 H基因編碼合成的,該基因位于人類染色體12q22,含有19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子,負(fù)責(zé)合成含有611個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。不同地區(qū)和人群中關(guān)于LTA4H基因與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病相關(guān)性的研究結(jié)論并不完全一致。QIU等[8]研究顯示,人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中LTA4H m RNA的表達(dá)增加,并且其表達(dá)量與斑塊不穩(wěn)定性呈正相關(guān),即其表達(dá)的量越多斑塊就越不穩(wěn)定。de-CODE研究小組研究顯示,Hap K為編碼LTA4H基因的單倍體,攜帶Hap K人群心肌梗死的發(fā)病率高于對(duì)照組:在冰島人群中,心肌梗死病人中攜帶Hap K者約占14.5%,明顯高于對(duì)照人群的攜帶率(10.4%);而且經(jīng)過(guò)伊屋諾霉素刺激后,心肌梗死病人的粒細(xì)胞可以產(chǎn)生更多的LTB4;在美國(guó)人群中,非洲裔美國(guó)人攜帶Hap K頻率比歐洲裔美國(guó)人低,但是攜帶Hap K使非洲裔美國(guó)人心肌梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高3.57倍,歐洲裔美國(guó)人心肌梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高1.16倍[9]。最近一項(xiàng)研究顯示,Hap K能使高加索人群患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)提高1.2倍[10]。BEVAN等[11]對(duì)872例英國(guó)IS病人和601例德國(guó)IS病人研究顯示,LTA4 H基因的表達(dá)使小血管發(fā)生病變的風(fēng)險(xiǎn)提高1.041～2.262倍,LTB4受體復(fù)合物的單倍體型使心源性卒中的風(fēng)險(xiǎn)提高1.194～3.760倍,白三烯通路成員及其受體的遺傳變異增加了這兩個(gè)種群IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),而且發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的高低取決于IS的亞型。各文獻(xiàn)結(jié)果不一致,原因可能與樣本量的選擇、樣本的遺傳因素和環(huán)境因素的影響不同有關(guān)。

本文研究結(jié)果顯示,病例組和對(duì)照組LTA4H-rs2660845基因型AA、AG、GG和等位基因A、G頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LTA4H-rs2660845位點(diǎn)基因多態(tài)性與IS的發(fā)生無(wú)相關(guān)性,病例組各亞組基因型、等位基因分布差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與張晶[12]的研究結(jié)果一致。由于條件的限制,本文沒(méi)有對(duì)所研究人群血液中LTs濃度進(jìn)行測(cè)定,如能對(duì)研究人群血液LTs濃度進(jìn)行測(cè)定,可以更好地了解該基因位點(diǎn)變異與IS發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

綜上所述,LTA4H-rs2660845位點(diǎn)基因多態(tài)性與IS的發(fā)生無(wú)相關(guān)性,未發(fā)現(xiàn)LTA4 H-rs2660845基因多態(tài)性能增加IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

THE RELATIONSHIP BETWEEN LEUKOTRIENE A4 GENE POLYMORPHISM AND CEREBRAL ISCHEMIC STROKE

HOU Shugang,SUN Ying,LIU Lijun,ZHOU Chang,ZHANG Chen (Department of Neurology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo explore the relationship between leukotriene A4 hydrolase(LTA4H)gene polymorphism and cerebral ischemic stroke(CIS).MethodsBy employing a case control study,the LTA4H-rs2660845 gene polymorphism in 380 CIS patients and 290 healthy subjects were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).ResultsCompared with the control group,the differences of distribution of LTA4H-rs2660845 genotype(AA, AG,GG)and allele frequencies(A,G)in CISgroup and its subgroup were not significant(P＞0.05).ConclusionThe polymorphism of LTA4H-rs2660845 is unlikely to be involved in the development of CIS.

leukotriene A4;cerebrovascular accident;polymorphism,restriction fragment length

R743

A

1008-0341(2013)04-0325-03

10.11712/qlyx201304014

2013-02-28;

2013-06-13

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010HM061)

侯樹(shù)剛(1985-),男,在讀碩士研究生。

張晨(1957-),男,教授,碩士生導(dǎo)師。