■陳天龍 張 敏

（延邊大學，吉林延吉 133000）

隨著百姓生活水平的提高及健康和環(huán)保意識的強化，人們逐漸把無公害、無污染、安全、優(yōu)質(zhì)的綠色畜禽產(chǎn)品作為餐桌上的主要消費品。由于養(yǎng)殖業(yè)長期進行不合理的抗生素使用引發(fā)細菌耐藥性,使畜禽體內(nèi)菌群失調(diào)并造成二度感染,引起畜禽機體免疫力下降,且常有藥物殘留于動物產(chǎn)品及環(huán)境當中的狀況發(fā)生。針對養(yǎng)殖業(yè)使用抗生素等飼料添加劑所造成的危害,研究開發(fā)新型綠色飼料添加劑就顯得尤為重要。紅曲霉早在我國的食品加工業(yè)中得到過廣泛的應用，近年研究又發(fā)現(xiàn)紅曲霉次級代謝產(chǎn)物具有保健和藥用價值。酵母菌是在養(yǎng)殖業(yè)中應用比較早的微生物添加劑，其代謝產(chǎn)物的安全性和營養(yǎng)價值已被養(yǎng)殖業(yè)認可，并得到廣泛的應用，但未見關(guān)于紅曲霉與酵母混合制備合生元的報道。

本試驗是利用混菌之間有共生和互補的營養(yǎng)作用，能克服發(fā)酵過程中產(chǎn)生的不利的影響，增加發(fā)酵的效果，試驗宗旨篩選出紅曲霉菌和酵母菌混合發(fā)酵制備合生元的最佳比例，并找出最佳混合發(fā)酵的時間，最佳混合發(fā)酵的溫度。為紅曲霉-酵母菌合生元能在未來的畜禽生產(chǎn)中應用推廣提供理論依據(jù)，為飼料添加劑行業(yè)開發(fā)新的微生物代謝物添加劑資源奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紅曲霉、酵母菌由延邊大學動物營養(yǎng)實驗室提供。

1.1.2 材料

去皮馬鈴薯、蔗糖、瓊脂、水。

1.1.3 主要試劑

瓊脂粉、葡萄糖、0.2%冰乙酸。

1.1.4 主要器材

加熱鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、玻璃培養(yǎng)皿、接種環(huán)、分光光度、凱式定氮儀。

1.2 方法

PDA培養(yǎng)基（土豆培養(yǎng)基）的制作：將馬鈴薯去皮、挖掉芽眼后稱量200 g，切成1 cm見方的小方塊。將切好的馬鈴薯塊加適量水后放入鍋中加熱，煮至酥而不爛。用雙層沙布過濾，取濾汁，放在加熱鍋中加入20 g糖。在沸騰狀態(tài)下加入15 g瓊脂，邊加邊攪拌,直到瓊脂完全溶化為止，用蒸餾水定容至1 000 ml。裝入玻璃平皿內(nèi)，約0.5～0.7 cm深，高壓滅菌25 min晾涼待用。

1.2.1 菌種間相容性試驗

將紅曲霉和酵母菌分別接種在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)72 h后放在4℃冰箱中保存待用。把酵母菌接種到接有紅曲霉的PDA固體培養(yǎng)基上。取兩個PDA平板作為對照，分別接種紅曲霉和酵母菌,于適合大多菌體生長的溫度32℃恒溫培養(yǎng)7 d(紅曲霉在土豆培養(yǎng)基中的生長周期)后觀察生長情況。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素篩選試驗

1.2.2.1 發(fā)酵時間

先在6個PDA固體培養(yǎng)基上接種紅曲霉，32℃培養(yǎng)7 d，第1～6 d每天在一個接有紅曲霉的培養(yǎng)基平板上接種等量的酵母菌。觀察各組生長狀況，測定莫納可林K含量、蛋白質(zhì)含量,確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.2.2 接種比例

將配制比例分別為紅曲霉∶酵母菌比為1∶3，2∶5，1∶2，1∶1，2∶1，5∶2，3∶1的比例接種到培養(yǎng)基中，于適合大多菌體生長的溫度32℃恒溫培養(yǎng)7 d，測定莫納可林K含量、蛋白質(zhì)含量,確定最佳發(fā)酵比例。

1.2.2.3 發(fā)酵溫度

按照上述接種比例將紅曲霉和酵母菌接種于PDA培養(yǎng)基中，分別于29、30、31、32、33、34 ℃進行培養(yǎng)，培養(yǎng)發(fā)酵7 d結(jié)束后，測定莫納可林K含量、蛋白質(zhì)含量,確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3 最佳條件下的發(fā)酵培養(yǎng)試驗

用兩只三角瓶內(nèi)裝0.2%的冰乙酸溶液少許，裝入土豆培養(yǎng)基的平皿冷卻后取已培養(yǎng)的紅曲霉分5～8次注入到10 ml的0.2%的冰乙酸溶液中，取3 ml接種于土豆培養(yǎng)基上，于32℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d然后取已培養(yǎng)的酵母菌同樣分5～8次注入到10 ml的0.2%的冰乙酸溶液中，取1 ml接種于已經(jīng)培養(yǎng)4 d的接有紅曲霉的土豆培養(yǎng)基上,繼續(xù)于32℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至第7 d。

烘干：將培養(yǎng)好的紅曲霉與酵母菌混合濕粉攤?cè)肴萜鲀?nèi)，放入55℃的烘箱內(nèi)，干燥12～14 h，然后取出粉碎制成粉狀。

1.2.4 測定指標

發(fā)酵產(chǎn)物中,Monacolink的測定采用紫外分光光度法。

發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量測定采用凱式定氮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種兼容性試驗

從兼容性試驗的結(jié)果來看,紅曲霉的生長與酵母菌比較相對較慢,酵母菌先長滿整個平板，說明兩者之間可以兼容共生，但紅曲霉菌絲生長多少受到一些抑制，也許因為酵母菌生長的更快，爭奪了紅曲霉的生長空間，使它無法快速生長，長滿整個平板需要較長的時間。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化單因素篩選

2.2.1 發(fā)酵時間

圖1 發(fā)酵時間對混合菌種發(fā)酵的影響

從圖1可以看出，蛋白含量、Monacolink含量在紅曲霉發(fā)酵的第4 d接種酵母菌均達到最高，此后繼續(xù)接種發(fā)酵結(jié)果則相反。因為菌體生長到達穩(wěn)定期和最高生長期時，菌種數(shù)量最多，代謝產(chǎn)物最多，產(chǎn)酶量最大,蛋白含量最高,菌種過了最高生長期，菌絲數(shù)量減少,從而使代謝產(chǎn)物和蛋白含量都降低。故最適宜的發(fā)酵接種時間為紅曲霉發(fā)酵接種的第4 d。

2.2.2 接種比例

從圖2可以看出混菌接種比例為紅曲霉∶酵母菌為3∶1時，蛋白含量、Monacolink含量達到較理想的水平，而其它接種比例會使蛋白含量最低而Monacolink含量很高或者蛋白含量最高而Mo?nacolink含量很低。當接種比例不適宜時，混合菌種互相又競爭生長空間和養(yǎng)分，既而導致微生物菌群生長不好，也符合上述菌種兼容試驗的結(jié)果，故最適宜的接種比例為3∶1。

圖2 接種比例對混菌發(fā)酵的影響

2.2.3 發(fā)酵溫度

圖3 發(fā)酵溫度對混菌發(fā)酵的影響

從圖3可以看出，混菌發(fā)酵溫度在32℃時蛋白含量、Monacolink含量均達到最高。故最適宜的發(fā)酵溫度為32℃。

2.3 最優(yōu)化條件的實踐發(fā)酵試驗

經(jīng)試驗確定了紅曲霉、酵母菌混合發(fā)酵制備合生元的最佳條件為：混合菌種（紅曲霉∶酵母菌=3∶1）在32℃，在紅曲霉接種培養(yǎng)4 d時接種酵母菌混合發(fā)酵至第7 d。對在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)獲得的發(fā)酵產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)和Monacolink含量的測量，結(jié)果見表1。

表1 最優(yōu)條件下發(fā)酵后蛋白和Monacolink含量

3 討論

合生元(synbiotics)是一種益生素與益生元(prebiotics)復合性的生物制劑,是目前關(guān)于綠色飼料添加劑中研究較多的一種新型微生態(tài)制劑。由于合生元自身組成的特殊性，其在動物體內(nèi)可同時發(fā)揮益生素與益生元的雙重作用，具備選擇性促進腸道中有益活菌定植作用，從而達到提高動物健康水平的目的，間接提高動物的生產(chǎn)效率。

本試驗所研究的紅曲霉和酵母菌雙菌發(fā)酵制備的合生元是一種新型無公害、綠色的微生物飼料添加劑。紅曲霉菌在生長過程中能夠產(chǎn)出豐富的活性酶類,紅曲色素和Monacolink等，其代謝產(chǎn)生的紅曲色素和活性酶類具有很強的益生作用,而Mona?colink具有顯著的抑制膽固醇合成的作用,同時可明顯改變畜產(chǎn)品質(zhì)量。酵母菌無論對于單胃動物還是反芻動物都不可缺少的益生菌。酵母菌在提供給動物優(yōu)質(zhì)菌體蛋白時,還同時提供給動物大量的B族維生素,可明顯提高動物的生產(chǎn)效率。通過實驗室內(nèi)的微生物培養(yǎng)實驗研究,發(fā)現(xiàn)紅曲霉和酵母菌可以兼容共生,但由于兩菌種在相同環(huán)境下生長周期和生長能力不同而有一定拮抗作用,通過混合菌種優(yōu)化條件的篩選，能降低競爭抑制,達到最佳培養(yǎng)效果。

紅曲霉和酵母菌混合制備合生元的條件一旦研究成熟，其作用就會具備雙重功效，既能提高畜禽機體免疫能力,又能促進動物體內(nèi)營養(yǎng)素的吸收，并可以改善畜禽消化道內(nèi)環(huán)境。在畜產(chǎn)品生產(chǎn)中可有效抑制脂肪和膽固醇在畜禽產(chǎn)品中的沉積。畜禽生產(chǎn)中使用合生元，不必擔心藥物和銅、鐵、鋅在畜產(chǎn)品中的殘留，更不必擔心添加劑對環(huán)境的污染問題。此項目研究如果可繼續(xù)做動物生產(chǎn)試驗和畜產(chǎn)品品質(zhì)影響試驗，就可以進一步證實該項研究在動物生產(chǎn)中的可應用性,在養(yǎng)殖業(yè)上也一定具有應用價值。

4 小結(jié)

試驗結(jié)果表明，酵母菌與紅曲霉之間存在拮抗作用但是可以共生,但需要控制適當?shù)幕旌习l(fā)酵的條件才能達到較理想效果；最佳混合發(fā)酵條件：在PDA培養(yǎng)基上，混合菌種（紅曲霉∶酵母菌=3∶1）在32℃的環(huán)境溫度下，在紅曲霉接種培養(yǎng)4 d時接種酵母菌混合發(fā)酵至第7 d，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白含量、Monacolink含量，達到較理想的水平。

（參考文獻若干篇，刊略，需者可函索）