■ 劉婉盈鄧 波 徐子偉 李 偉,3

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

鋅是動物所必需的微量元素之一，動物體內(nèi)適宜的鋅水平對維持動物的生長、發(fā)育和免疫功能起著非常重要的作用。對畜牧生產(chǎn)來說，如果飼料中不添加額外的鋅，動物很可能發(fā)生原發(fā)性和繼發(fā)性缺鋅。缺鋅將導(dǎo)致細胞免疫損傷、DNA氧化損傷、線粒體功能紊亂，最重要的是導(dǎo)致細胞過早老化。研究發(fā)現(xiàn)，鋅與金屬硫蛋白之間存在密切的聯(lián)系，主要是鋅可以直接調(diào)控金屬硫蛋白基因的表達，而金屬硫蛋白直接調(diào)節(jié)體內(nèi)鋅的吸收和代謝，維持體內(nèi)鋅的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。動物體內(nèi)金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）含量偏低，將使得細胞對凋亡因子更敏感，這說明MT影響信號通路來調(diào)節(jié)細胞凋亡，也間接說明鋅對體內(nèi)新陳代謝和細胞凋亡的影響。因此本文綜述了MT與鋅代謝的關(guān)系和鋅對不同動物金屬硫蛋白表達的影響，為深入了解鋅的作用提供參考。

1 金屬硫蛋白

1957年，由Margoshes和Vallee在馬腎皮質(zhì)中首次分離出了金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）。MT是一種富含半胱氨酸、低分子量的蛋白質(zhì)，它與鋅和其它重金屬有較強的親和力，可以由很多因素誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動物的MT基因有一個或者多個同源序列，不同的動物含有的MT同源基因的數(shù)量并不一致。同一個種屬，不同動物的MT基因也不同，如雞、鴨、火雞等，擁有相同的MT基因，而鳥屬中的鴿子、鵪鶉就分別擁有兩個MT同源基因。不同功能的同源基因翻譯出不同的蛋白亞型(MT異構(gòu)體)。哺乳動物的MT有4種異構(gòu)體：MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。其中MT-1和MT-2在動物的肝臟、胰臟、腎臟和小腸等組織中表達豐富；MT-3主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，MT-4主要分布在皮膚、舌、消化道等的角質(zhì)細胞和復(fù)層鱗狀上皮細胞中。哺乳動物金屬硫蛋白一般由61～68個氨基酸組成，含有21個半胱氨酸殘基，其三級結(jié)構(gòu)式由α和β兩個球狀金屬結(jié)構(gòu)域組成。MT在細胞代謝中涉及多種功能，如：轉(zhuǎn)運、儲存金屬離子、解毒金屬離子富集產(chǎn)生的細胞毒害作用、離子的體內(nèi)平衡、自由基清除、免疫應(yīng)答和對抗疾病。

2 MT與鋅代謝的關(guān)系

MT結(jié)合某些金屬離子，因此，避免了金屬離子的毒性。如果體內(nèi)自由鋅離子濃度提高，就會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯折疊，并且通過對線粒體的作用產(chǎn)生細胞毒性，引起氧化應(yīng)激。

無金屬結(jié)合的MT稱為硫蛋白(thionein)，其高級結(jié)構(gòu)為無序結(jié)構(gòu)，但一旦結(jié)合金屬離子，就會改變構(gòu)象，折疊成有序的結(jié)構(gòu)。在細胞內(nèi)不同位置均發(fā)現(xiàn)MT的存在，MT涉及從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運鋅離子至細胞核內(nèi)，用于細胞增殖，或者使鋅離子轉(zhuǎn)運至線粒體的膜間隙，用于調(diào)節(jié)呼吸作用。MT同時也存在于細胞外間隙中，細胞通過內(nèi)吞途徑，使攜帶著金屬離子的MT進入細胞質(zhì)。MT可調(diào)控鋅的自穩(wěn)態(tài)，而體內(nèi)攝入的鋅也影響組織中MT的含量。

鋅及其蛋白質(zhì)配體的相互作用取決于MT中半胱氨酸的硫基，MT以Zn3S9和Zn4S11兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)合鋅。然而，對鋅的親和力而言，不同結(jié)合部位相差很大的數(shù)量級。7個鋅離子與巰基的結(jié)合力是不同的，其中4個鋅離子結(jié)合力最強(logK=11.8)，2個鋅離子結(jié)合力偏弱(logK≈10)，1個鋅離子結(jié)合力最弱(logK=7.7)，這個發(fā)現(xiàn)說明結(jié)合MT的鋅具有動力學(xué)不穩(wěn)定性。MT對鋅代謝的影響是通過半胱氨酸巰基可逆的氧化還原反應(yīng)釋放或者結(jié)合鋅離子來調(diào)節(jié)的，所以MT起到了緩沖體內(nèi)鋅的能力，使體內(nèi)自由鋅濃度在一個穩(wěn)定范圍內(nèi)，而其他含鋅蛋白由于鋅在體內(nèi)總是以二價形式存在，氧化還原能力不活潑。在對鋅的吸收利用上，有研究證明，MT和另一種含巰基的蛋白CRIP（半胱氨酸豐富蛋白）共同負責(zé)結(jié)合腸道中的鋅，調(diào)節(jié)鋅的吸收，小腸MT的水平與鋅的吸收呈明顯的反比關(guān)系。

3 鋅對不同動物MT表達的影響

研究發(fā)現(xiàn)，鋅可影響腸道和肝臟中基因的表達，促進生長。金屬硫蛋白(MT)具有促進細胞生長、發(fā)育的功能。在腸道黏膜細胞中，鋅的吸收受MT的調(diào)節(jié)，而日糧鋅濃度可以刺激腸道和肝臟中MT-mRNA的表達。MT與腸細胞內(nèi)鋅結(jié)合配體相競爭，控制著跨基膜轉(zhuǎn)運入循環(huán)系統(tǒng)中鋅的數(shù)量。日糧鋅濃度升高，則各組織器官中MT濃度也隨之升高，其調(diào)控機理可能是通過第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo)實現(xiàn)的，鋅與金屬反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子(MTF)結(jié)合，識別MT基因啟動子上的特異序列金屬反應(yīng)元件(MRE)，并結(jié)合到DNA序列上，從而啟動轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)，在雞飼料中添加鋅可以使雞肝Zn和Zn-MT含量明顯增加，這說明雞體內(nèi)Zn的儲備主要是通過Zn-MT的形式實現(xiàn)的。Carlson等推測腸細胞內(nèi)鋅的增加和MT一起可能有利于蛋白質(zhì)的合成和細胞的分裂增殖，從而促進腸道健康，促進動物生長。鋅對不同動物和不同組織MT及MT-mRNA表達的誘導(dǎo)能力不同，下面分別介紹不同動物受鋅誘導(dǎo)組織中MT表達受到的影響。

3.1 鋅對家禽MT表達的影響

黎云等采用RT-PCR(引物設(shè)計見表1)方法研究兩種鋅源對艾維茵肉仔雞肝臟MT-mRNA基因表達的影響，結(jié)果表明，日糧中添加60 mg/kg的硫酸鋅和氨基酸絡(luò)合鋅均能提高肉仔雞肝臟MT-mRNA的豐度，但與硫酸鋅相比，日糧中添加氨基酸鋅顯著提高了肝臟MT-mRNA基因表達的水平(P＜0.05)。

表1 家禽MT和內(nèi)參基因的上下游引物序列

李發(fā)弟等也采用了RT-PCR方法（引物設(shè)計見表1）檢測不同鋅添加水平對蛋雞肝臟和腎臟中MT-mRNA表達水平的影響。結(jié)果表明：基礎(chǔ)飼糧中添加60 mg/kg鋅可顯著提高成年蛋雞肝臟中MT基因的表達水平，而對腎臟中MT-mRNA的表達無顯著性影響，提示鋅調(diào)節(jié)組織中MT的基因表達和蛋白合成并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系，且其影響具有組織特異性。丁小波等研究發(fā)現(xiàn)，含鋅40、60 mg/kg的納米氧化鋅組能顯著提高肝臟中MT的生成量(P＜0.05)。以上試驗說明硫酸鋅或氨基酸絡(luò)合鋅的添加量為60 mg/kg時，能有效地提高雞機體金屬硫蛋白的表達。

3.2 鋅對哺乳動物MT表達的影響

徐振華等報道，分別以硫酸鋅和蛋氨酸鋅形式添加40、80、120 mg/kg鋅對2～3月齡生長肉兔金屬硫蛋白表達（引物設(shè)計見表2）的影響，隨著日糧鋅水平的增加，肝臟、腎臟MT-1mRNA相對表達豐度呈先升高后降低趨勢，且80 mg/kg添加水平時兩種鋅源MT-1mRNA相對表達豐度均達到最高。

表2 哺乳動物MT和內(nèi)參基因的上下游引物序列

許梓榮等發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)，顯著提高了仔豬肝臟組織中MT的含量，其中3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)組肝臟MT含量是對照組(100 mg/kg)的13倍。Lopez-Alonson等研究了鎘、銅、鋅對豬肝臟和腎臟金屬硫蛋白表達能力的影響，結(jié)果表明，不管是肝臟還是腎臟，MT的表達都取決于鋅的水平，雖然人們普遍認為銅和鎘比鋅有更強的結(jié)合MT的能力，但是試驗結(jié)果卻是在肝臟中隨著MT濃度的增高，MT結(jié)合銅和鎘的比例逐漸下降，也就是說MT結(jié)合銅和鎘的比例直接取決于鋅。故用金屬硫蛋白來評價豬體內(nèi)鋅營養(yǎng)水平是比較準(zhǔn)確的。筆者采用RT-PCR法（引物設(shè)計見表2）檢測了不同鋅源及鋅水平對豬肝臟金屬硫蛋白的影響(未發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)80 mg/kg添加水平MT-mRNA相對表達豐度最高，與徐振華等在肉兔上的試驗結(jié)果類似。

Vicki等研究了給年輕人補充鋅對單核細胞和紅細胞中金屬硫蛋白表達的影響（引物設(shè)計見表2），在18 d內(nèi)給年輕人每天補充50 mg的鋅，參照為空白對照，試驗結(jié)果表明，在補充鋅8 d后，紅細胞中金屬硫蛋白含量顯著高于對照組，補充鋅2 d后單核細胞中金屬硫蛋白mRNA的水平顯著高于對照組，在18 d以后，不管是單核細胞還是紅細胞，加鋅組金屬硫蛋白的表達都相應(yīng)地提高。而加鋅組的血漿鋅含量在結(jié)束補鋅后的6 d內(nèi)仍比對照組高，直到22 d后，加鋅組血漿鋅水平才降到對照組的水平。此試驗表明，單核細胞金屬硫蛋白mRNA和紅細胞內(nèi)金屬硫蛋白含量均能反映攝取鋅的水平，并且單核細胞金屬硫蛋白mRNA對鋅水平的反應(yīng)速度要比紅細胞金屬硫蛋白快。Sullivan等用競爭性反轉(zhuǎn)錄PCR法測定了單核細胞內(nèi)MT-mRNA水平，指出單核細胞MT-mRNA評定Zn代謝狀況要比血漿Zn更有意義。

4 研究展望

動物體內(nèi)適宜的鋅水平對生物體的生長發(fā)育、免疫、抗應(yīng)激及物質(zhì)代謝等多方面起著非常重要的作用，故給動物日糧中補充鋅是非常有必要的，但是添加量的多少，則可以通過金屬硫蛋白的表達進行評定，若通過組織鋅或者血漿鋅來評定鋅的添加量，則可能已經(jīng)超過動物所需的量，并且反應(yīng)存在很大的遲緩。由于鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白的表達在不同動物、不同組織中受到的影響存在差異，所以要更加準(zhǔn)確的用金屬硫蛋白來評定動物體內(nèi)鋅的營養(yǎng)狀況，應(yīng)就不同動物選取此動物受影響最為敏感的組織作為試驗材料。

（參考文獻29篇，刊略，需者可函索）