黃誠梅，楊翠芳，3，潘有強，魏源文，鄧智年，呂維莉，李楊瑞，2

（1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室,南寧530007；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室,南寧530007；3.廣西師范大學(xué),桂林541004）

可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI基因在不同甘蔗基因型中表達(dá)分析

黃誠梅1，楊翠芳1，3，潘有強1，魏源文1，鄧智年1，呂維莉1，李楊瑞1，2

（1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室,南寧530007；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室,南寧530007；3.廣西師范大學(xué),桂林541004）

探討與蔗糖代謝相關(guān)的甘蔗可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（soluble acid invertase，SAI）基因時空表達(dá)，比較了桂糖28號（GT28）、拔地拉、新臺糖20號（ROC20）、新臺糖22號（ROC22）四個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘和幼莖4個部位在工藝成熟期中甘蔗SAI基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在工藝成熟期甘蔗SAI在4個甘蔗基因型中4個部位均檢測到其有表達(dá)，但甘蔗SAI表達(dá)水平在不同甘蔗基因型與組織部位因在不同工藝成熟階段而有所差異。其中，SAI基因在工藝成熟前期有較高表達(dá)，而后逐漸下低，但在不同基因型的不同部位中表達(dá)規(guī)律性不是很明顯，這可能與所用的甘蔗材料遺傳背景等有關(guān)。

甘蔗；可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶；基因表達(dá)

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我國最為重要的糖料作物。蔗糖占世界食糖總產(chǎn)量的70%以上,占我國食糖總產(chǎn)量的90%以上。作為C4高生物量和高纖維作物,使甘蔗成為一種理想的能源作物。

甘蔗節(jié)間生長及其蔗糖積累過程是一個非常復(fù)雜的生理生化過程,參與蔗糖合成代謝相關(guān)的酶主要有中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase,NI）、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（soluble acid invertase,SAI）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase,SPS）和蔗糖合成酶（sucrose synthase,SS）［1］。SAI是一個非常重要的調(diào)控酶,在許多植物中SAI都直接調(diào)控蔗糖的累積［1-4］。在甘蔗中,SAI酶活性與蔗糖含量具有明顯的相關(guān)性［1,3,5］,SPS酶活性與蔗糖含量沒有明顯的相關(guān)性,而SPS與SAI酶活性比值與蔗糖含量的相關(guān)性高達(dá)0.93。SAI在果實生長發(fā)育和糖分積累中具有重要的調(diào)控作用,是大多數(shù)植物果實生長發(fā)育和蔗糖積累的關(guān)鍵酶之一［4,6-7］。SAI調(diào)控源-庫關(guān)系所起的作用已經(jīng)在C3模式植物如煙草、擬南芥、馬鈴薯和番茄中得到證明。目前,SAI基因已從番茄［8］、玉米［9］、水稻［10］、葡萄［11］、柑橘［12］、甜瓜［4］、甜高粱［13］等植物中被克隆,并對其進(jìn)行相關(guān)功能研究。甘蔗SAI基因于1998年成功克?。ˋF062735、AF062734）,該基因家族的其它成員也先后被成功克隆出來,如scinvh（AF083855）、scinvh3'2（AF083856）、Shcw1（AY302084）、ShinvA（AY302083）,但僅獲得基因片段序列,對于該基因家族的功能及表達(dá)特性等方面研究報道較少。本研究通過半定量與熒光定量PCR方法對甘蔗SAI基因在工藝成熟期不同甘蔗基因型及其不同部位中的表達(dá)水平進(jìn)行分析,以探討該基因表達(dá)特性以及為了解其對甘蔗高產(chǎn)高糖的貢獻(xiàn)作用,這將為甘蔗高產(chǎn)高糖的生產(chǎn)及其育種目標(biāo)提供一個有效選擇標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1實驗材料

供試甘蔗材料包括桂糖28號（GT28）、果蔗拔地拉（Badila）、新臺糖20號（ROC20）、新臺糖22號（ROC22）,由廣西作物改良生物技術(shù)重點開放實驗室提供。

甘蔗總RNA提取Trizol購自Invitrogen公司；定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq、DNA Maker、Ex-Taq酶、dNTPs Mixture、載體pMD-18-T-Vector、IPTG、X-Gal等均購自寶生物工程（大連）有限公司（Takara）；熒光定量PCR擴增引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司（Invitrogen）合成；所用的菌株為由本實驗室保存的大腸桿菌JM109,小量膠回收試劑盒購自上海華禹生物工程有限公司、上海華堯核酸技術(shù)有限公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。定量PCR儀為BIO-RAD iCycler iQ熒光定量PCR儀。

1.2實驗方法

1.2.1 材料種植、取樣試驗在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚進(jìn)行,采用口徑為35 cm、桶底直徑為28 cm的黑色塑料桶裝沙質(zhì)土壤進(jìn)行桶栽,于2011年1月18日下種,每桶4～6芽,齊苗后定苗,每桶2～3株,其余管理措施與一般桶栽試驗的管理相同。取樣于2011年8月29日（甘蔗處于生長后期、工藝成熟初期）進(jìn)行,取樣方法參考楊翠芳等［14］進(jìn)行采樣,液氮速凍后混勻分裝保存用于總RNA提取。

1.2.2 基因表達(dá)分析（1）引物設(shè)計：根據(jù)GenBank中甘蔗SAI基因的核酸序列（登錄號AF062735）,利用Primer Premier 5.0軟件分析設(shè)計半定量與定量RT-PCR特異引物,引物序列為：aF1：5'-CGT CCT ACA ACC ACG ACT ACA T-3'和aR1：5'-GGT ACA AGA AGA TGC TTC GCT AT-3'。內(nèi)參基因的引物參考甘蔗的看家基因25S rRNA的實時PCR引物［15］,引物序列為：RF2：5'-GCAG CCAA GCGT TCAT AGC-3'和RR2：5'-CCTA TTGG TGGG TGAA CAAT CC-3'。

（2）甘蔗總RNA提取及cDNA第一鏈合成：參照Invitrogen的TRIZOL方法［14］提取甘蔗各部位的總RNA。取各個部位的總RNA 500 ng,用TaKaRa公司AMV Reverse Transcriptase XL反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,反應(yīng)結(jié)束后將cDNA第一鏈凍置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）甘蔗SAI基因的半定量RT-PCR分析：以甘蔗工藝成熟中期（2011年11月11日）各基因型各個部位的cDNA第一鏈為模板,以目的基因甘蔗SAI引物及內(nèi)參基因25S rRNA的引物進(jìn)行半定量RT-PCR擴增,分析SAI的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系與程序參考楊翠芳等［14］進(jìn)行。反應(yīng)完成后,取5μL擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

（4）甘蔗SAI基因的實時熒光定量PCR分析：采用BIO-RAD iCycler iQ熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增,分別用甘蔗工藝成熟時期各種部位的cDNA為模板分別進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因的定量擴增,每個樣品設(shè)3個重復(fù)。另外,每批設(shè)ddH2O作為模板的空白對照。以25S rRNA為內(nèi)參基因,設(shè)定GT28+1葉為校準(zhǔn)樣本,其它部位均為待測樣品,2-△△Ct法分析基因相對表達(dá)水平,比較SAI基因在各組織部位表達(dá)差異。

反應(yīng)條件為：94℃,2 min,94℃,30s,50～55℃,15s,Plate Read,72℃,30s,go to line 2 for 40個循環(huán),melting cure from 55.0℃to 90.0℃,reading every 1.0℃holding 10s。

（5）數(shù)據(jù)分析：將2-△△Ct法分析和修正的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到EXCEL軟件,生成各個樣本的相對表達(dá)量圖譜,并采用DPS v8.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,以Duncan多重比較檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1甘蔗SAI基因的半定量RT-PCR分析

圖1結(jié)果顯示,在甘蔗工藝成熟中期,SAI基因表達(dá)水平以在GT28的4個部位較其它3個品種的高,其次是果蔗Badila,而在相對早熟高糖品種ROC20與ROC22中表達(dá)量較低。

2.2甘蔗SAI基因的熒光定量RT-PCR分析

2.2.1 甘蔗工藝成熟初期SAI基因表達(dá)分析從圖2中可見,在甘蔗工藝成熟初期,SAI在4個甘蔗基因型中的+1、0葉、幼嫩葉鞘和幼莖中均檢測到其有表達(dá),但SAI表達(dá)因甘蔗基因型不同而有所差異。4個甘蔗基因型以ROC22幼嫩葉鞘相對表達(dá)量最高,其次該品種的幼莖與+1葉相對表達(dá)量也較高,而以GT28在4個部位中相對表達(dá)量稍低,ROC20+1葉相對表達(dá)量最低。

2.2.2 甘蔗工藝成熟中期SAI基因表達(dá)分析在甘蔗工藝成熟中期,SAI相對表達(dá)量在4個甘蔗基因型的+1葉、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的相對表達(dá)量均較工藝成熟初期的低,較于GT28+1葉的低,尤其是在ROC22,這與半定量PCR結(jié)果相似,在相對早熟高糖品種ROC20與ROC22中表達(dá)量均較低（圖3）。

2.2.3 甘蔗工藝成熟后期SAI基因表達(dá)分析在甘蔗工藝成熟后期,SAI相對表達(dá)量在4個甘蔗基因型中以在ROC22幼嫩葉鞘與ROC20+1葉中表達(dá)量高,其次為果蔗Badila幼嫩葉鞘,在其它品種中其它部位均有較低的相對表達(dá)量（圖4）。

圖1 甘蔗工藝成熟中期SAI基因半定量表達(dá)分析

圖2 甘蔗工藝成熟初期（2011年8月29日）SAI基因表達(dá)分析

圖3 甘蔗工藝成熟中期（2011年11月11日）SAI基因表達(dá)分析

圖4 甘蔗工藝成熟后期（2011年12月21日）SAI基因表達(dá)分析

3 討論

蔗糖是甘蔗光合作用的主要產(chǎn)物之一,也是植物體內(nèi)光合產(chǎn)物運輸與分配的主要形式,蔗糖在甘蔗中以一種定向運輸和分配的方式調(diào)控甘蔗的整個生長和發(fā)育進(jìn)程（包括相關(guān)的生理過程、生化代謝途徑和基因表達(dá)等）,同時也決定甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)［16］。在甘蔗［1］、果實［7］等蔗糖積累代謝研究表明,與蔗糖代謝相關(guān)的酶有SAI、NI、SS和SPS。而SAI在許多植物中直接調(diào)控蔗糖的累積［1-4］。在甘蔗中,SAI酶活性與蔗糖含量具有明顯的相關(guān)性［1,3,5］。本研究以不同甘蔗基因型的+1葉、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖為試材,通過半定量與熒光定量PCR方法對可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因時空表達(dá)差異進(jìn)行分析,探討了該基因表達(dá)特性以及進(jìn)一步了解其對甘蔗高產(chǎn)高糖的貢獻(xiàn)作用。

試驗研究表明,在工藝成熟期甘蔗SAI在4個甘蔗基因型中4個部位中均檢測到其有表達(dá),但甘蔗SAI表達(dá)水平在不同甘蔗基因型與組織部位因在不同工藝成熟階段而有所差異。其中在成熟初期,4個甘蔗基因型以ROC22幼嫩葉鞘、幼莖與+1葉相對表達(dá)量均較高,而以GT28在4個部位中相對表達(dá)量稍低,ROC20+ 1葉相對表達(dá)量最低。在中期,SAI相對表達(dá)量在4個甘蔗基因型的+1葉、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的相對表達(dá)量均較工藝成熟初期的低,明顯低于GT28+1葉,這與半定量PCR結(jié)果相似,在相對早熟高糖品種ROC20與ROC22中表達(dá)量均較低。到了成熟后期,以在ROC22幼嫩葉鞘與ROC20+1葉中表達(dá)量高,其次為果蔗Badila幼嫩葉鞘,在其它品種中其它部位均有較低的相對表達(dá)量。通過對SAI基因在成熟期中相對表達(dá)量分析表明,SAI基因在前期有較高表達(dá),而后逐漸降低,而在不同基因型的不同部位中表達(dá)規(guī)律不是很明顯,這可能與所用的甘蔗材料遺傳背景等有關(guān),這與本課題組楊翠芳等［14］研究甘蔗SPSⅢ表達(dá)情況結(jié)果相同。其中GT28、ROC20、ROC22都是生產(chǎn)上的甘蔗品種,遺傳背景差異很大。而Badila是甘蔗屬中的熱帶種典型代表之一,2n=80,遺傳背景較單一［17］。Ashok K.Verma等［18］研究表明,低糖甘蔗品種葉片的酸性轉(zhuǎn)化酶活性較高,而中性轉(zhuǎn)化酶活性較低。相關(guān)分析結(jié)果表明,葉片酸性轉(zhuǎn)化酶活性與蔗糖分呈負(fù)相關(guān),而與己糖含量呈正相關(guān)；相反,葉片中性轉(zhuǎn)化酶與蔗糖分呈正相關(guān),與己糖含量呈負(fù)相關(guān)。郭家文等［19］研究表明,在甘蔗成熟期,葉片的酸性轉(zhuǎn)化酶活性隨著甘蔗的成熟而降低,中性轉(zhuǎn)化酶活性隨著甘蔗的成熟而升高,不同的供試材料具有不同的酶活性變化,材料間的差異較大。至于SAI在高、低糖甘蔗基因型及不同成熟度節(jié)間的表達(dá)水平與蔗糖代謝之間的關(guān)系等,我們正在繼續(xù)研究,以進(jìn)一步探討SAI基因表達(dá)對甘蔗糖分積累的影響。

[1]Zhu YJ,Komor E,Moore PH.Sucrose accumulation in the sugarcane stem is regulated by the difference between the activities of soluble acid invertase and sucrose phosphate synthase[J].Plant Physiol,1997,115（2）：609-616.

[2]Rita Zrenner,Konrad Schüler,Uwe Sonnewald.Soluble acid invertase determines the hexose-to-sucrose ratio in cold-stored potato tubers[J].Planta,1996,198（2）：246-252.

[3]Lingle SE,Tew TL.A comparison of growth and sucrose metabolism in sugarcane germplasm from Louisiana and Hawaii[J].Crop Science,2008,48（3）：115-1163.

[4]Tian HM,Kong QG,Feng YQ,Yu XY.Cloning and characterization of a soluble acid invertase-encoding gene from muskmelon[J]. Mol.Biol.Rep.,2009,36（3）：611-617.

[5]潘有強,羅海玲,李楊瑞.甘蔗節(jié)間蔗糖含量與和蔗糖代謝相關(guān)的4種酶活性之間的關(guān)系剖析[J].植物生理學(xué)通訊,2007,43（5）：861-864.

[6]趙智中.柑橘果實糖積累的生理基礎(chǔ)研究[D].杭州：浙江大學(xué),2001.

[7]樊繼德.甜瓜酸性轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)特性分析及功能鑒定[D].濟(jì)南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[8]Elliott KJ,Buttler WO,Dickinson CD,Konno Y,Vedvick TS,Fitzmaurice L,Mirkov TE.Isolation and characterization of fruit vacuolar invertase genes from two tomato species and temporal differences in mRNA levels during fruit ripening[J].Plant Mol Biol,1993,21（3）：515-524.

[9]Kim JY,MahéA,Guy S,Brangeon J,Roche O,Chourey PS,Prioul JL.Characterization of two members of the maize gene family, Incw3 and Incw4,encoding cell-wall invertases[J].Gene,2000,245（1）：89-102.

[10]Ji X,Van den Ende W,Van Laere A,Cheng S,Bennett J.Structure,evolution,and expression of the two invertase gene families of rice[J].J.Mol.Evol.,2005,60（5）：615-634.

[11]Davies C and Robinson SP.Sugar accumulation in grape berries.Cloning of two putative vacuolar invertase cDNAs and their expression in grapevine tissues[J].Plant Physiol.,1996,111（1）：275-283.

[12]Liu Y,Liu Q,Xiong J,Deng X.Difference of a citrus late-ripening mutant（Citrus sinensis）from its parental line in sugar and acid metabolism at the fruit ripening stage[J].Sci.China C Life Sci.,2007,50（4）：511-517.

[13]Jain M,Chourey PS,Li QB,Pring DR.Expression of cell wall invertase and several other genes of sugar metabolism in relation to seed development in sorghum（Sorghum bicolor）[J].J.Plant Physiol.,2008,165（3）：331-344.

[14]楊翠芳,黃誠梅,潘有強,等.甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表達(dá)的初步研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012,43（6）：723-726.

[15]Hayati MI,Robert SS,Rosanne EC,Graham DB,Donald J M,John MM.Comparison of reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of gene expression in sugarcane[J].Plant Molecular Biology Reporter,2004,22（4）：325-337.

[16]王俊剛,趙婷婷,張樹珍,等.甘蔗體內(nèi)的蔗糖轉(zhuǎn)運與運輸途徑[J].植物生理學(xué)通訊,2008,44（3）：605-611.

[17]王英,高和瓊,莊南生,等.崖城割手密11號與拔地拉核型比較分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2008,24（3）：52-57.

[18]Ashok K.Verma,S.Solomon,Praveen C.Verma,Ashok Singh,S.B.Singh.Relationship between invertase（s）activity and sucrose metabolism in the leaves of high and low sugar cultivars of sugarcane（Saccharum officinarum L.）[J].Guangxi Agricultural Sciences,2010,41（4）：313-318.

[19]郭家文,劉少春,張躍彬,等.成熟期不同基因型甘蔗糖分和葉片酶活性的變化[J].中國糖料,2006（3）：16-18,21.

Expression Analysis of Soluble Acid Invertase Gene SAI in Different Sugarcane（Saccharum officinarum L.）Varieties

HUANG Cheng-mei1,YANG Cui-fang1,3,PAN You-qiang1,WEI Yuan-wen1,DENG Zhi-nian1,LV Wei-li1,LI Yang-rui1,2
(1.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab,Nanning 530007,China;2.Sugarcane Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement,Ministry of Agriculture,Nanning 530007,China;3.Guangxi Normal University,Guilin 541004,China)

The temporal and spatial expression of soluble acid invertase(SAI)gene related to sucrose metabolism in sugarcane(Saccharum officinarum L.)was investigated.Four sugarcane varieties,GT28,Badila, ROC20 and ROC22 were used as experimental materials.1st and 0 leaf,young sheath and young stalk were sampled to assay the expression of SAI in the technical maturing stage.The results showed that SAI was expressed in all four sampled parts,i.e.,1st and 0 leaf,young sheath and young stalk in all four sugarcane genotypes,but the expression levels varied in different genotypes,different parts and different stages.The expression of SAI was higher in the early technical maturing phase,and low in the late technical maturing phase. No general pattern was observed for the expression of SAI in differentgenotypes and parts during different stages passibly due to their genetic backgrounds.

sugarcane;soluble acid invertase;gene expression

S566.101；Q78

：A

1007-2624（2013）02-0021-04

2013-02-19

廣西自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團(tuán)隊項目(2011GXNSFF018002)、廣西自然科學(xué)基金項目（2011GXNSFA018111）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目：科技創(chuàng)新能力與條件建設(shè)（桂科能0815011-6-1）、科技攻關(guān)計劃（桂科攻1222009-1B）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項[200802Z（基）]、科技發(fā)展基金項目（2007024）。

黃誠梅（1979-）,女,副研究員,博士,研究方向：甘蔗栽培與分子生物學(xué)。E-mail:huangchengmei@gxaas.net

李楊瑞（1957-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向：甘蔗栽培學(xué),E-mail:liyr@gxaas.net