王 星 白秀娟

(遼東學(xué)院，丹東，118003) (東北農(nóng)業(yè)大學(xué))

貉(Nyctereutes procyonoides)是珍貴的毛皮動物，與狐、水貂并稱為毛皮動物產(chǎn)業(yè)的“三大支柱”，是重要的制裘原料，我國貉的飼養(yǎng)量目前居世界首位。貉屬于犬科動物，中國貉(Nyctereutes procyonoides procyonoides Gray)和日本貉(Nyctereutes procyonoides νiνerrinus Temminck)是公認的貉的2 個亞種，染色體有不同的數(shù)目和形態(tài)［1］。烏蘇里貉(Nyctereutes procyonoides Ussuriansis)是中國貉的地理亞種，是我國飼養(yǎng)的主要品種［2］。染色體核型、帶型分析是確定動物分類地位和進行遺傳特性研究的重要方法和內(nèi)容。研究烏蘇里貉染色體的核型、帶型，為犬科動物分類、染色體多態(tài)性及進化提供依據(jù)，也為基因的染色體定位奠定遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗動物:成年、健康雄性烏蘇里貉2 只，取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)烏蘇里貉飼養(yǎng)基地，為野生烏蘇里貉與家養(yǎng)烏蘇里貉的雜交后代。

試劑:胎牛血清(Sigma)，RPMI Medium 1640(Gibco)，PHA、秋水仙素、胰蛋白酶均為國產(chǎn)分析純，購自哈爾濱伊事達生物有限公司。

儀器:生物顯微鏡(OLYMPUS B ×51);超凈操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表廠);超純水凈化裝置(Milli - Q，ZMQS50F01);數(shù)碼相機(Nikon COOLPIX 4500)。

細胞培養(yǎng)基:RPMI1640 培養(yǎng)液4 mL，胎牛血清1 mL，PHA2.5 mg，青霉素500 IU，鏈霉素500 IU，抽濾滅菌，分裝于25 mL 的培養(yǎng)瓶，置于冰箱中冷藏保存?zhèn)溆茫科烤C合培養(yǎng)基約5 mL。胎牛血清解凍后56 ℃滅活30 min，1 mL/管分裝后儲于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PBS 緩沖液:按V(0.2 mol/L Na2HPO4)∶ V(0.2 mol/L NaH2PO4)=38 ∶ 62 的比例配制pH =7. 0 PBS 緩沖液。高壓滅菌，分裝后儲于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

KCl 低滲溶液(0.075 mol/L):將5.592 g KCl用蒸餾水溶解后定容至1 L。

卡諾氏固定液:V(甲醇)∶ V(冰乙酸)=3∶ 1，現(xiàn)用現(xiàn)配。

Giemsa 原液:稱取Giemsa 染色素1.0 g 倒入研缽，量取甘油66 mL，加少許于研缽中充分研磨，加全部甘油后，置56 ℃2 h，期間每隔20 min 攪動1次，待冷卻后加66 mL 甲醇，攪勻后倒入棕色試劑瓶，室溫保存20 d 后即可使用。

秋水仙素:用PBS(pH =7.0)配制成濃度為20 g/L 的原液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

烏蘇里貉血液淋巴細胞培養(yǎng):用裝有抗凝劑(肝素鈉)的一次性5 mL 注射器，從烏蘇里貉前肢采血1 ～5 mL。將血樣迅速帶回實驗室，并無菌條件下在每個培養(yǎng)瓶內(nèi)滴入0.5 ～1.0 mL 抗凝血，封嚴瓶口，將培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)72 h，每隔12 h 輕輕搖晃一次。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h 加入秋水仙素。加入秋水仙素終濃度為0.4 mg/L，然后繼續(xù)培養(yǎng)。觀測由培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細胞制備的染色體標本片，并計算各自的有絲分裂指數(shù)。

烏蘇里貉染色體標本的制備:1 000 r/min 室溫離心10 min，棄上清。加預(yù)熱的KCl 低滲液(37 ℃)9 mL，于37 ℃水浴30 min。加約1 mL 卡諾氏固定液預(yù)固定，吸打均勻，2 000 r/min 室溫離心10 min。棄上清，用9 mL 固定液于室溫固定20 min。2 000 r/min，離心10 min，棄上清。用9 mL 固定液第2 次固定，室溫20 min。此時可放入4 ℃保存。2 000 r/min，離心10 min，棄上清。用9 mL 固定液進行第3次固定，室溫20 min。2 000 r/min 室溫離心10 min，棄上清，視淋巴細胞多少用適量(0.2 ～0.5 mL)固定液重懸細胞。滴2 ～4 滴細胞懸液于-20 ℃預(yù)冷的載玻片上。室溫放置，空氣干燥。

烏蘇里貉染色體核型分析:用新配制的Giemsa染色液(V(原液)∶ V(PBS)=1 ∶ 9)染色20 ～30 min，蒸餾水沖洗，空氣干燥。用顯微鏡觀察，選擇分散程度良好、無丟失、背景清晰的分裂相進行顯微照相，打印，經(jīng)剪切配對，用游標卡尺測量，根據(jù)測量結(jié)果計算出烏蘇里貉染色體的3 個參數(shù)(臂比、著絲粒指數(shù)、相對長度)，并進行剪貼、配對和編號。臂比=長臂長度/短臂長度。著絲粒指數(shù)=(短臂長度/染色體長度)×100%。相對長度=(某一染色體長度/(全部常染色體長度+X 染色體長度))×100%。

貉染色體G 帶分析:選取制作好的染色體玻片標本，空氣干燥，老化3 ～5 d。在0.25%胰蛋白酶工作液內(nèi)處理10 ～20 s。在PBS 緩沖液內(nèi)漂洗30 s×3次。姬姆薩磷酸緩沖液(1∶ 9)內(nèi)染色20 ～30 min 分鐘。蒸餾水沖洗，空氣干燥。鏡檢染色體G 帶分裂相。選擇分散程度良好、無丟失、背景清晰的分裂相進行顯微照相，打印，并將各同源染色體配對。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏蘇里貉染色體核型分析

觀察了30 個細胞分裂中期染色體，絕大多數(shù)細胞的二倍體常染色體數(shù)目為52，常染色體可分為兩組:一組是5 對具亞中部著絲粒染色體(SM)，一組是21 對具端著絲粒的染色體(T)(表1)。兩組染色體沒有特征性標志，其長度遞次減小。本研究中染色體標本中發(fā)現(xiàn)B 染色體，多為2 個，數(shù)目不等。

烏蘇里貉染色體計數(shù)結(jié)果表明2n =54 +2B，常染色體中有10 條雙臂染色體和44 條單臂染色體，Y 染色體是很小的端著絲點染色體，X 染色體是中間著絲點染色體(見圖1)。常染色體按同源染色體配對，然后再依染色體大小遞減排列，按照中部、亞中部和端部著絲點染色體從長到短排列，測量每個細胞的染色體長度，計算出其相對長度，臂比值和著絲粒指數(shù)(見表1)，根據(jù)以上結(jié)果進行配對，并進行核型分析(見圖1)。

表1 染色體的相對長度、著絲粒指數(shù)和臂比

2.2 烏蘇里貉染色體G 帶分析

在染色體G 帶分析中，G 帶數(shù)量與染色體長度相關(guān)，G 帶的質(zhì)量與酶的濃度及消化時間長短有關(guān)(圖2)。秋水仙素可以增加中期分裂相的比例，還可以使中期染色體縮短和使染色體單體更加分散，從而使染色體輪廓更加清晰。但秋水仙素濃度過高或處理時間過長，則有可能導(dǎo)致標本中的分裂相增多，染色體收縮過短，難于計數(shù)與分析。因此選擇適當?shù)那锼伤貪舛群妥饔脮r間，對染色體標本的制備來說尤為重要。本試驗中，貉淋巴細胞在0. 4 mg/L 和4 h 的作用時間下，即可獲得較高的標準分裂相的比例和分裂指數(shù)。胰蛋白酶消化是染色體顯帶中比較關(guān)鍵的一步，把握準胰蛋白酶消化的時間極其重要。消化時間長，則染色體的帶消化過度，不顯帶;如果消化時間過短，染色后染色體的深、淺帶反差不大。不同廠家產(chǎn)胰蛋白酶的活性不同，在試驗時一定要摸索。本試驗中，在0.25%胰蛋白酶工作液內(nèi)處理10 ～20 s 可以獲得較滿意效果。

圖1 烏蘇里貉染色體核型

圖2 烏蘇里貉染色體G 帶分析圖

3 討論

烏蘇里貉常染色體可分為兩組:一組是5 對具亞中部著絲粒染色體，一組是21 對具端著絲粒的染色體。本研究中個別標本中發(fā)現(xiàn)B 染色體，多為2個，數(shù)目不等。研究報道芬蘭貉有3 個B 染色體［3］，中國貉也有發(fā)現(xiàn)B 染色體的報道［1］。

染色體組型分析與郭健民、王宗仁等的報道基本一致［4-5］。但在本研究中，X 染色體為具中間著絲點的中等大小染色體。王宗仁、郭健民等研究認為貉X 性染色體是具端著絲粒的染色體，與本試驗結(jié)果不同。在本試驗中，從X 染色體來看，與M?kinen 等［6］、Pieńkowska 等［3］、Nie 等［1］的研究結(jié)果類似。郭健民所用的貉捕于秦嶺，王宗仁所用貉捕于北京，M?kinen 用的貉取自芬蘭和日本，本次試驗的選用的貉為黑龍江烏蘇里貉，為家養(yǎng)和野生貉的雜交后代，因此，可能是中國貉不同的地理亞種引起結(jié)果不完全一致。在20 世紀40年代，日本衣川雄曾將中國貉和朝鮮貉混分成7 個亞種:烏蘇里貉、朝鮮貉、阿穆爾貉、江西貉、閩越貉、湖北貉、云南貉［2］。不同亞種及地理亞種間可能存在高頻率的個體內(nèi)染色體數(shù)的多態(tài)性和X 染色體的形態(tài)變異。

食肉動物是目前研究物種染色體進化的最佳選擇，它們同屬于哺乳動物并且有相似的基因組結(jié)構(gòu)，即高度重排、染色體核型高度保守。他們祖先有一致的染色體組型(ACK)，應(yīng)該為2n =42［7］。在古老的犬科的進化過程中存在著激烈的基因組重排。大約在3 500 ～4 500 萬年的食肉目動物演變過程中，食肉目比任何其他物種發(fā)生得更廣泛，至少有67 個重排發(fā)生。在1 000 萬年前就有現(xiàn)存的犬科動物，染色體核型重排的演變也非常廣泛，尤其是狐和貉。日本貉與食肉目祖先核型相比，染色體組型至少發(fā)生22 次重排［8］。烏蘇里貉X 染色體形態(tài)差異是否是由于重排引起的還有待于進一步證明。

1929年，Minouchi 報道了日本貉二倍體染色體數(shù)目為2n=38 +4B (包括4 個B 染色體)，這個結(jié)果后來被Todd 證實［9］。M?kinen［6］及Smith［10］等報道了芬蘭貉的染色體核型為2n =56，包括5 對近端著絲粒和21 對端著絲粒的常染色體。X 染色體具中間著絲點，Y 染色體小中間著絲點。B 染色體為中等大小，具近端著絲粒［6］。日本貉、芬蘭貉和中國貉在染色體組型上的差異，充分證明了貉的染色體數(shù)目的多態(tài)性和X 染色體的形態(tài)變異的多樣性。

貉原生于西伯利亞東部，日本，中國和中南半島北部，在1928—1958年期間，大約有10 萬只貉被引進到俄國西部，包括高加索、哈撒克斯坦、西伯利亞等地區(qū)［6］。后來又從蘇聯(lián)的歐洲部分擴散到斯堪的納維亞(半島)和歐洲中部，目前已經(jīng)是芬蘭主要飼養(yǎng)的毛皮動物之一［11］。本次研究結(jié)果表明，烏蘇里貉與芬蘭貉X 染色體形態(tài)相似，5 對具亞中部著絲粒染色體G 帶帶型相似程度較高［6］，與Nie 等研究中國貉染色體G 帶相似程度更高［1］(圖3)，烏蘇里貉與芬蘭貉可能有較近的親緣關(guān)系。日本貉從分類上屬于貉的一個亞種，芬蘭貉是屬于引進物種，與中國貉的親緣有關(guān)系還有待于進一步驗證。

研究不同亞種以及中國貉不同的地理亞種的貉在染色體上的微細差異，有助于了解貉在體型、毛被顏色與密度等方面在進化過程中形成的明顯差異。通過對貉染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)的研究，有助于了解貉起源和進化歷程，可以為生物的分類和系統(tǒng)演化、親緣種的鑒定、群落結(jié)構(gòu)分析等問題的探討提供細胞遺傳學(xué)依據(jù)。

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