黃 玥，陸文蔚，唐立偉，黃靈潔，白 晨*

(上海商學(xué)院旅游與食品學(xué)院，上海 200235)

熒光分光光度法對黃酒氧自由基吸收能力檢測方法的建立

黃 玥，陸文蔚，唐立偉，黃靈潔，白 晨*

(上海商學(xué)院旅游與食品學(xué)院，上海 200235)

目的：建立用熒光分光光度計測定黃酒氧自由基吸收能力(ORAC)的改進方法。方法：以市售黃酒為樣品，使用熒光分光光度計，以熒光半數(shù)衰減時間為觀察指標，通過Trolox標準曲線，換算得到黃酒的ORAC值，并測定最低檢測限、重復(fù)性精密度、平行性精密度、加標回收率等。結(jié)果：激發(fā)波長為490nm，發(fā)射波長為517nm。相對熒光半數(shù)衰減時間與Trolox濃度的線性回歸方程為Y=7.2357X-0.8189，線性決定系數(shù)R2為0.9948，檢測范圍0.28～8.00μmol/L，方法的重復(fù)性精密度為3.02%，平行性精密度為2.69%，加標回收率在93.00%～102.00%之間。檢測樣品的ORAC值為4.68～5.21μmol/mL。結(jié)論：ORAC熒光分光光度法簡化了操作步驟，縮短了實驗時間，同時保證了良好的準確度、精密度和穩(wěn)定性，適用于測定不同品牌不同年份黃酒的ORAC。

黃酒；發(fā)酵酒；氧自由基吸收能力；熒光素；熒光分光光度法

黃酒是以稻米、黍米等為主要原料，經(jīng)加曲、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒，酒精度(以體積計)為8%～20%，歷來以營養(yǎng)豐富、保健養(yǎng)生著稱，是行家推崇、民間贊賞的傳統(tǒng)保健養(yǎng)生佳品[1]。近年來，已有學(xué)者開始對黃酒抗氧化活性進行研究[2-6]，目前抗氧化活性評價方法很多，但尚未建立黃酒抗氧化活性評價的完善體系。

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)，又譯為總抗氧化能力，其檢測方法——ORAC法是近年來國際推薦的抗氧化活性分析標準方法之一[7]。該方法使用熒光素(fluorescein，F(xiàn)L)為氧化底物，以2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為過氧自由基來源，以抗氧化劑作用下，熒光衰退曲線下面積與熒光自然衰退曲線下面積的差作為衡量抗氧化劑的抗氧化能力指標，結(jié)果以抗氧化劑Trolox作為標準進行表達，用來定量表征樣品的抗氧化能力[8-9]。與其他抗氧化活性評價方法相比，ORAC法是以清除自由基為基礎(chǔ)的測定方法[10]，該法可提供穩(wěn)定可控的自由基，這些自由基與生命現(xiàn)象中的自由基具有高度的一致性[9]?；谄渖锵嚓P(guān)性強、方法準確、靈敏度高等優(yōu)點[11]，該方法廣泛應(yīng)用于檢測保健食品、植物抗氧化提取物、生物樣品等的總抗氧化能力[12-16]，但目前國內(nèi)外有關(guān)黃酒ORAC檢測的研究尚未見報道，由于黃酒為我國獨有酒種，因而有必要建立黃酒ORAC檢測方法。

ORAC法以往一般使用全自動熒光酶標儀作為測定儀器，由于該機器價格昂貴，限制了ORAC法在我國的普及，與之相比，熒光分光光度計價格低廉、應(yīng)用廣泛[8]；另外，觀察指標熒光衰退曲線下面積的檢測過程費時費力，相對而言熒光半數(shù)衰減時間的測定較為簡單。因此本實驗使用熒光分光光度計，以熒光半數(shù)衰減時間為觀察指標，建立黃酒氧自由基吸收能力檢測的改進方法，為完善黃酒的體外抗氧化活性評價指標提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別選擇市售黃酒中銷售量較大的兩個品牌，品牌Ⅰ(產(chǎn)地上海)、品牌Ⅱ(產(chǎn)地浙江)的3年陳、5年陳、8年陳酒樣作為檢測樣品。

熒光素(fluorescein，F(xiàn)L)、Trolox標準品(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromate-2-carboxylicacid)、2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH) 美國Sigma公司；三水合磷酸氫二鉀、二水合磷酸二氫鈉國藥集團化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

970CRT熒光分光光度計 上?，F(xiàn)科儀器有限公司；MS105DU電子天平 梅特勒-托利多中國公司。1.3 方法[8-9]

1.3.1 檢測波長的選擇

取一潔凈干燥試管，加入63nmol/L的FL使用液0.3mL、75mmol/L磷酸鹽緩沖液3.6mL，充分混合后置于熒光分光光度計中掃描激發(fā)和發(fā)射光譜圖，確定最適宜激發(fā)波長和發(fā)射波長。

1.3.2 樣品檢測和標準曲線繪制

黃酒樣品用75mmol/L的磷酸緩沖液進行適當(dāng)稀釋(pH7.4)，取0.3mL于樣品管中待測。將Trolox儲備液(終濃度40μmol/L)加75mmol/L磷酸鹽緩沖液依次稀釋成濃度為8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25μmol/L六個Trolox標準溶液，取6支潔凈干燥試管，對應(yīng)加入Trolox標準溶液各0.3mL，另取2支潔凈試管作為對照管，1支為自由基對照(＋AAPH)管、1支為空白對照(－AAPH)管。樣品管和標準溶液管中均加入75mmol/L 磷酸鹽緩沖液0.3mL；(＋AAPH)管和(－AAPH)管分別加入75mmol/L 磷酸鹽緩沖液0.6mL和3.6mL；然后向各管分別加入終濃度63nmol/L的FL使用液0.3mL，混勻；在檢測前除(－AAPH)管外向各管加入終濃度6mmol/L的AAPH 3mL，充分混勻并開始計時，記錄熒光半數(shù)衰減時間t。

熒光半數(shù)衰減時間的記錄方法：以(－AAPH)管的熒光值為一個單位，當(dāng)熒光值降低到0.5個單位時所用的時間即熒光半數(shù)衰減時間。

連續(xù)測定自由基對照管(＋AAPH)熒光半數(shù)衰減時間8次，均數(shù)記為t+AAPH。

計算標準溶液和樣品的相對熒光半數(shù)衰減時間，即：熒光半數(shù)衰減時間-t+AAPH，以標準溶液相對熒光半數(shù)衰減時間為縱坐標，Trolox 濃度為橫坐標繪制標準曲線，以樣品的相對熒光半數(shù)衰減時間比對標準曲線，得到樣品對應(yīng)Trolox濃度，通過換算得出樣品的ORAC值。檢測樣品的ORAC值以1mL樣品等同于Trolox的物質(zhì)的量表示，單位為μmol/mL。

ORAC值/(μmol/mL)= (tsample-t+AAPH)/(tTroloxt+AAPH)×Trolox濃度/(μmol/L)×10-3×(VTrolox/Vsample)×樣品稀釋倍數(shù)

式中：VTrolox/Vsample為檢測體系中使用的Trolox體積和樣品體積之比。

1.3.3 最低檢測限

連續(xù)測定自由基對照管(＋AAPH)熒光半數(shù)衰減時間8次，得到標準偏差s，最低檢測限=3s/K。式中，K為標準曲線斜率。

1.3.4 重復(fù)性精密度

每天取1mL黃酒樣品用75mmol/L的磷酸緩沖液稀釋至1000mL，準確量取稀釋后的樣品0.3mL，連續(xù)測定5d，分別計算ORAC值及RSD值。

1.3.5 平行性精密度

準確量取經(jīng)稀釋后的黃酒樣品0.3mL 5份，分別計算ORAC值及RSD值。

1.3.6 加標回收率

準確量取1mL黃酒樣品2份，向其中一份中定量加入0.5mg Trolox(即2μmol Trolox)，用75mmol/L的磷酸緩沖液分別稀釋至1000mL，然后取分別取0.3mL經(jīng)稀釋后的樣品，按1.3.2節(jié)方法平行操作，重復(fù)測定熒光半數(shù)衰減時間5次，計算加標回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

首先，設(shè)定激發(fā)波長為485nm，掃描發(fā)射波長，得最大發(fā)射光譜峰在517.2nm(圖1A)。然后設(shè)定發(fā)射波長為517nm，掃描激發(fā)波長，得最大激發(fā)光譜峰在490.4nm(圖1B)。因此，確定檢測的最佳激發(fā)波長為490nm、發(fā)射波長為517nm。

圖1 FL發(fā)射(A)和激發(fā)(B)光譜圖Fig.1 Excitation spectrum of sodium fluorescein

2.2 Trolox標準曲線

由于本文考慮的是齊次Boltzmann方程，所以先簡單回顧下關(guān)于齊次Boltzmann方程已經(jīng)解決的問題.1971年Arkeryd首先利用逼近的方法解決了在硬勢、角截斷條件下解的存在性[4]，不久他進一步利用L1 空間中的弱緊性及碰撞算子的弱形式證明了在-1≤β<0及非角截斷情形弱解的存在性[5].1997年， Goudon推廣了這種方法， 在-2≤β<0情形下證明了解的存在性[6].隨后Villani深入研究了-4<β> <-2時的情形，并給出了新型的弱解[7]， 由于此類解與熵有關(guān)， 將其稱為H解.β

實驗結(jié)果表明，t+AAPH為9.43min，相對熒光半數(shù)衰減時間(Y)與Trolox濃度(X)有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=7.2357X-0.8189，線性決定系數(shù)R2為0.9948。

文獻[17]采用ORAC酶標儀法，以熒光衰退曲線下保護面積為縱坐標、Trolox濃度(1.00～8.00μmol/L)為橫坐標繪制標準曲線，線性決定系數(shù)R2≥0.994。本檢測方法的線性決定系數(shù)與文獻基本相近，符合檢測要求。

用熒光分光光度計測定熒光衰退曲線下面積費時費力，測定一個樣品需要間隔2min測一個數(shù)據(jù)，連續(xù)測定120min[8,18-20]，用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積，則大大簡化了數(shù)據(jù)檢測工作量，時間也相對簡短，約為60min，因而以熒光半數(shù)衰減時間為觀察指標具有相對的優(yōu)越性。

2.3 最低檢測限

表1結(jié)果顯示，該方法的最低檢測限為0.28μmol/L，因此標準曲線工作范圍為0.28～8.00μmol/L。通過對黃酒樣品進行稀釋，檢測數(shù)值均在標準曲線工作范圍之內(nèi)，此方法可以滿足檢測需要。

表1 最低檢測限測定結(jié)果Table1 The minimum detection limit of the established method

該方法采用FL為熒光指示劑，F(xiàn)L熒光非常穩(wěn)定，但在自由基作用下會被氧化，如AAPH產(chǎn)生的過氧化自由基能夠使FL氧化導(dǎo)致熒光衰退，因此，在有自由基存在的狀態(tài)下，在一定波長下FL的熒光強度逐漸減弱。本實驗使用熒光分光光度計并采用熒光定量，靈敏度高。

2.4 重復(fù)性實驗由表2可知，方法重復(fù)性精密度為3.02%，說明方法重復(fù)性較好，檢測條件較易控制，檢測結(jié)果較穩(wěn)定。

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果Table2 Results of repeated experiments

2.5 平行性精密度

表3 平行性實驗結(jié)果Table3 Results of parallel experiments

表3結(jié)果顯示，方法平行性精密度為2.69%，說明方法平行性檢測誤差小，檢測結(jié)果較滿意。

2.6 加標回收率

表4結(jié)果顯示，加標回收率范圍在93.00%～102.00%之間，與文獻[8,21]報道的加標回收率(90%～104%)相近，說明該方法較為穩(wěn)定，此次加標回收率結(jié)果較好，說明檢測方法誤差較小，準確度較高，可以滿足檢測需要。

表4 加標回收率實驗結(jié)果Table4 Results of recovery experiments with spiked samples

2.7 黃酒樣品ORAC值測定結(jié)果

為了能在標準曲線工作范圍內(nèi)進行檢測，黃酒樣品首先用75mmol/L磷酸鹽緩沖液進行稀釋(1:1000)，兩個品牌不同年份黃酒ORAC值如表5所示，其范圍為4.68～5.21μmol/mL，本方法適用于不同品牌不同年份黃酒ORAC值的檢測。

表5 黃酒氧自由基吸收能力ORAC(x±s，n==33))Table5 ORAC of Chinese rice wine (x ±s，n==33))μmol/mL

3 結(jié) 論

ORAC法在我國應(yīng)用并不普遍，主要原因是受到了儀器設(shè)備的限制，本實驗用熒光分光光度計替代全自動熒光酶標儀，用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積，建立了改進的實驗方法。實驗結(jié)果表明，ORAC熒光分光光度法簡化了操作步驟，縮短了實驗時間，同時保證了良好的準確度、精密度和穩(wěn)定性，該方法操作簡單，不需昂貴設(shè)備，適用于測定不同品牌不同年份黃酒的氧自由基吸收能力。

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Determination of Oxygen Radical Absorbance Capacity in Chinese Rice Wine by Fluorescence Spectrophotometry

HUANG Yue，LU Wen-wei，TANG Li-wei，HUANG Ling-jie，BAI Chen*
(Department of Tourism and Food Science, Shanghai Business School, Shanghai 200235, China)

Objective: To establish a modif i ed method for the determination of oxygen radical absorbance capacity (ORAC) in Chinese rice wine by fluorescence spectrophotometry. Methods: Commercial samples of Chinese rice wine were determined by a fl uorescence spectrophotometer for fl uorescence half-decay time. As a result, a Trolox calibration curve was developed and used to calculate ORAC. The analytical method was validated with respect to limit of detection (LOD), precision for repeated and parallel determinations and spiked recovery. Results: The excitation wavelength was 490 nm, and emission wavelength was 517 nm. The regression equation between relative fl uorescence half-decay time and Trolox concentration was Y = 7.2357X － 0.8189 with R2of 0.9948 and detection range of 0.28–8.00 μmol Trolox/L. The precision for 5 repeated and 5 parallel determinations were 3.02% and 2.69%, respectively. The recovery rates of spiked samples were in the range of 93.00%–102.00%. The ORAC value of Chinese rice wine was 4.68–5.21 μmol Trolox/mL. Conclusion: Fluorescence spectrophotometry is a simple, time-saving, accurate, precise and stable method which is useful to determine ORAC in Chinese rice wines of different ages and from different brands

Chinese rice wine；fermented alcoholic beverage；oxygen radical absorbance capacity (ORAC)；f l uorescein (FL)；f l uorescence spectrophotometry

TS207.3；TS261.7

A

1002-6630(2013)18-0189-04

10.7506/spkx1002-6630-201318038

2012-08-23

中央財政支持地方高校發(fā)展專項(YC-D-4)；上海商學(xué)院教改項目(2012)；2011年度上海市教委重點課程建設(shè)項目

黃玥(1981—)，女，講師，博士研究生，研究方向為營養(yǎng)與食品安全。E-mail：huangysh@126.com

*通信作者：白晨(1969—)，女，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)。E-mail：baichen@fudan.edu.cn