關(guān) 明，侯俊峰，古再麗努爾·阿爾肯，艾散江·艾海提

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，污染監(jiān)測與控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054)

高效液相色譜分離與分析胡麻卵磷脂中磷脂酰膽堿

關(guān) 明，侯俊峰，古再麗努爾·阿爾肯，艾散江·艾海提

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，污染監(jiān)測與控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054)

目的：建立胡麻卵磷脂樣品中磷脂酰膽堿的高效液相色譜分離分析方法。方法：采用Platisil C18色譜柱(150mm×4.6mm，5?m)，檢測波長為215nm，流動相為乙腈-甲醇(50:50，V/V)，流速為1mL/min，以磷脂酰膽堿峰面積定量。結(jié)果：胡麻卵磷脂樣品中磷脂酰膽堿的含量為73.6%，平均回收率為103.3%，精密度(RSD)為0.28%，檢出限為0.25?g。結(jié)論：建立的方法準(zhǔn)確、高效，結(jié)果真實可靠。

高效液相色譜法；磷脂酰膽堿；胡麻卵磷脂

胡麻(Linum usitatissimum L.)是世界上僅次于大豆、油菜、向日葵和花生的油料作物[1]。在我國，胡麻主要分布在山西、內(nèi)蒙古、河北、甘肅、寧夏和新疆等省(區(qū))[2]。新疆地區(qū)在生產(chǎn)胡麻植物油的同時也生產(chǎn)出了胡麻油腳等副產(chǎn)品，油腳是生產(chǎn)卵磷脂的主要原料，但常被丟棄浪費，有待深度開發(fā)與利用。卵磷脂是一種混合物，包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酸(PA)等成分[3]，也是一種天然表面活性劑，在食品、藥品、油脂加工等領(lǐng)域有廣泛的用途，市場前景廣闊[4]。磷脂酰膽堿是卵磷脂的主要成分，能增強嬰兒智力，提高學(xué)習(xí)效率，尤其是胎兒，在生長發(fā)育中對磷脂酰膽堿的需求極大[5]。以高純度藥用大豆磷脂研制的抗癌新藥139針劑，目前在國內(nèi)市場供不應(yīng)求[6]。

目前，卵磷脂的分析方法有紫外-可見吸收光譜分析法[7-9]、柱層析法[10]、核磁共振光譜分析法[11]、薄層色譜法[12-14]、氧彈燃燒-灰化分光光度法[15]、高效毛細(xì)管電泳法[16]、高效液相色譜法[3,5,17-20]、微波消解-可見分光光度法[21]等，其中，常用高效液相色譜法對卵磷脂樣品中的磷脂酰膽堿進(jìn)行分離分析，但在報道的色譜條件下，流動相成本相對較大，磷脂酰膽堿出峰較慢，分離效率與分離效果有待改善。

本實驗以課題組從胡麻油腳原料中精制得到的胡麻卵磷脂為研究對象，擬利用高效液相色譜法，考察檢測波長、流動相配比對分離效果的影響，對胡麻卵磷脂樣品中的磷脂酰膽堿進(jìn)行分離分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純) 美國Fisher公司；胡麻卵磷脂樣品 本課題組精制；磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品(P3556，純度≥99%) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1100高效液相色譜系統(tǒng) 美國安捷倫公司；TU-1800雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Platisil柱(150mm×4.6mm，5?m)；流動相：乙腈-甲醇(50:50，V/V)；檢測波長215nm；流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10?L；柱溫25℃；以峰面積定量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品0.0052g，采用色譜純甲醇溶解于5mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為1.04mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻置于冰箱冷藏待用。

1.3.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取卵磷脂樣品0.1357g溶解于25mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為5.428mg/mL的溶液，取2mL稀釋至10mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度為1.087mg/mL的樣品溶液，搖勻置于冰箱待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

紫外掃描表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在207、228、271nm的波長處有較大吸收，207nm波長處有最大吸收，但考慮到溶劑甲醇在207nm波長處也有較大的吸收，為了減小基線噪音，選擇207、215、228、271nm 4個波長分別進(jìn)行了色譜分離，如圖1所示。

圖1 不同檢測波長處標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜分離情況Fig.1 Chromatographic separation of standard solution at different detection wavelengths

圖1 表明，不同檢測波長處標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜分離情況均良好。但是，207nm波長處溶劑甲醇也有較大吸收，會導(dǎo)致基線噪音很大，且雜質(zhì)峰較多；而271nm波長處響應(yīng)信號過小，不利于定量分析；215、228nm波長處，色譜圖中雜質(zhì)峰明顯減少，且可以避免溶劑甲醇的吸收干擾，相對于228nm波長而言，215nm與最大吸收波長207nm最為接近，最終，選定215nm為檢測波長。

2.2 流動相配比的選擇

為了進(jìn)一步優(yōu)化分離效果，獲得最佳色譜條件，建立適于卵磷脂中磷脂酰膽堿的色譜分離分析系統(tǒng)，實現(xiàn)最佳分離和準(zhǔn)確定量，考察不同配比流動相的分離情況，并進(jìn)行了分離效果對比，如圖2所示。

圖2 不同配比流動相下供試品溶液色譜分離情況Fig.2 Chromatographic separation of sample using different mobile phases

圖2 表明，甲醇-水為流動相的分離效果優(yōu)于單獨使用甲醇、乙腈為流動相的分離效果；乙腈-甲醇為流動相的分離效果優(yōu)于甲醇-水為流動相的分離效果；乙腈-甲醇(30:70，V/V)為流動相的分離效果較好，但PC峰與右側(cè)相鄰的小峰未能完全分離；乙腈-甲醇(50:50，V/V)為流動相的分離效果最佳，磷脂酰膽堿峰的保留時間為4.812min，分離度大于2，滿足高效液相色譜的分離要求。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照3、5、7、9、11μL不同進(jìn)樣量的方法，分別進(jìn)樣3次，以卵磷脂中磷脂酰膽堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，磷脂酰膽堿平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在3.12～11.44μg范圍內(nèi)，磷脂酰膽堿的質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A=90.97ρ-0.8742，回歸系數(shù)r=0.9999。

取1.3.2節(jié)所制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至原質(zhì)量濃度的1/100，按1.3.1節(jié)色譜條件，測得磷脂酰膽堿的檢出限(RSN=3)為0.25μg，略大于文獻(xiàn)[19]報道的0.20μg。

2.4 精密度實驗

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5μL，分別測得峰面積，計算RSD。如表1所示。

表1 精密度實驗結(jié)果Table1 The results of precision experiments

結(jié)果表明，RSD為0.28%，精密度良好，滿足實驗要求。

2.5 樣品測定

取供試品溶液進(jìn)樣，重復(fù)6次，每次10μL，分別測得峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得供試品中的磷脂酰膽堿的含量，已知樣品母液質(zhì)量濃度為5.43mg/mL，稀釋5倍的測量溶液質(zhì)量濃度為1.09mg/mL，計算出樣品磷脂酰膽堿的平均含量為73.6%，如表2所示。

表2 樣品測定結(jié)果Table2 The results of sample determination

2.6 回收率實驗

采用加標(biāo)回收法，分別取200、160、120μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到200μL的供試品溶液中，進(jìn)樣，每次10μL，每組平行測定兩次，計算平均回收率及RSD值，如表3所示。

表3 回收率實驗結(jié)果Table3 The results of recovery experiments

表3表明，平均回收率為103.3%，RSD為1.40%，方法準(zhǔn)確，滿足實驗要求。

3 討 論

卵磷脂組分比較復(fù)雜，在檢測過程中影響因素較多，本實驗采用高效液相色譜法對卵磷脂樣品中磷脂酰膽堿進(jìn)行了分離及含量測定，其分離效果好、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，為卵磷脂質(zhì)量分析與控制提供了借鑒和參考。流動相極性與配比的不同對樣品的分離有著至關(guān)重要的作用，文獻(xiàn)[3,18-19]報道采用硅膠柱，正已烷-異丙醇-醋酸為流動相，但磷脂酰膽堿的保留時間超過10min，分析時間增加；還有文獻(xiàn)[5]報道采用甲醇-1%磷酸(50:1，V/V)為流動相，但磷脂酰膽堿的保留時間長達(dá)13min，且峰形對稱性稍差；與文獻(xiàn)報道比較，本實驗采用極性較強的流動相，磷脂酰膽堿出峰時間明顯縮短，保留時間減少一半以上，分析時間得以節(jié)省，分析效率得到提高；此外，通過添加乙腈使峰形突顯，達(dá)到了改善峰形的目的，同時也減少了色譜峰的拖尾現(xiàn)象，分離效果得到改善，但隨著乙腈比例的增大，磷脂酰膽堿的分析效率降低，且成本增加，最終，本實驗采用甲醇-乙腈(50:50，V/V)為流動相，有效地對胡麻卵磷脂樣品中的磷脂酰膽堿進(jìn)行了分離，達(dá)到了較為滿意的分離效果。

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Separation and Analysis of Phosphatidylcholine in Flax Lethin by HPLC

GUAN Ming，HOU Jun-feng，GUZAILINUER·Aerken，AISANJIANG·Aihaiti
(Key Laboratory of Pollution Monitoring and Control, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, ?rümqi 830054, China)

Objective: To establish an HPLC method for the separation and analysis of phosphatidylcholin in fl ax lecithin. Methods: A Platisil C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used for chromatographic separation using acetonitrilemethanol (50:50, V:V) as mobile phase at fl ow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 215 nm. Results: The content of phosphatidylcholin in fl ax lecithin was 73.6%, and the average spiked recovery rate was 103.3%. The precision RSD for 6 replicate determinations was 0.28%, and the detection limit was 0.25 μg. Conclusion: The method is accurate, eff i cient and can provide reliable results.

high performance liquid chromatography (HPLC)；phosphatidylcholine；f l ax lecithin

TS207.3

A

1002-6630(2013)18-0223-04

10.7506/spkx1002-6630-201318045

2012-09-25

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目(2011211A031)

關(guān)明(1974—)，男，副教授，博士，研究方向為資源植物化學(xué)。E-mail：guanm@xjnu.edu.cn