元 媛，孔繁平，郝 珂，孟凡森，陳學(xué)群，杜繼曾

（浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究室，杭州310058）

低氧是一種非特異性應(yīng)激，刺激機體生理功能產(chǎn)生一系列反應(yīng)，表現(xiàn)為呼吸和心率增加、通氣量增加、心輸出量增多等，機體可以通過不同的分子機制來感受和適應(yīng)低氧環(huán)境。哺乳動物通過下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamus-pituitary-adrenalaxis，HPA axis）調(diào)節(jié)機體對外界的應(yīng)答和適應(yīng)反應(yīng)。下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing factor，CRF）是HPA軸的啟動者［1］，它調(diào)節(jié)神經(jīng)和體液兩大系統(tǒng)。其受體有CRFR1和CRFR2，其中CRF主要與CRFR1結(jié)合發(fā)揮重要生理作用。CRFR1屬G-蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCRs）家族，廣泛分布于腦和垂體。我們已研究證明CRFR1參與低氧應(yīng)激生理功能調(diào)節(jié)，對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中重要低氧靶基因和蛋白起核心主導(dǎo)調(diào)節(jié)作用［2］。

β-Arrestin是GPCRs信號通路的重要負調(diào)節(jié)因子，在機體組織廣泛存在，包括β-Arrestin1和β-Arrestin2。激活的GPCRs與G蛋白偶聯(lián)受體激酶（G-protein-coupled receptor kinases，GRK）結(jié)合后發(fā)生磷酸化，使β-Arrestin與GPCRs結(jié)合形成三聚體，使受體與G蛋白之間不能繼續(xù)作用，發(fā)生GPCRs的脫敏反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)了GPCRs的內(nèi)吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞凋亡等［3］。GRK3也和β-Arrestin一起共同參與調(diào)節(jié)GPCRs的內(nèi)在化［4］，所以本研究探討慢性低氧誘導(dǎo)的β-Arrestin1如何參與CRFR1脫敏以降低機體對低氧的反應(yīng)性。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)

實驗采用健康雄性、清潔級SD大鼠，體重（170±20）g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。人工控制光照（12L∶12D，光照時間為 6∶00-18∶00），環(huán)境溫度（20±2）℃，濕度為（50±5）%，飼養(yǎng)于30 cm×30 cm×25 cm的飼養(yǎng)籠中，每天9∶00稱量體重，打掃衛(wèi)生。大鼠可自由取食和飲水，飼養(yǎng)一周后用于實驗。

1.2 模擬低氧應(yīng)激

采用將動物大鼠置于透明的低壓低氧艙內(nèi)（貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司）模擬高原低氧，低氧組分為慢性連續(xù)低氧 5 km（10.8%O2，54.02 kPa）5 d、5 km（10.8%O2，54.02 kPa）15 d和急性低氧 7 km（8.2%O2，41.02 kPa）8 h、7 km（8.2%O2，41.02 kPa）24 h，共四個低氧組（n＝6），對照組（n＝6）不給予低氧處理。低氧結(jié)束后，大鼠被斷頭犧牲取樣。動物在艙內(nèi)有足夠的食物和水，而且光線、溫度、濕度都與飼養(yǎng)環(huán)境相同。

1.3 組織準(zhǔn)備

低氧處理后，動物被迅速斷頭犧牲取大腦，用液氮冷凍后保存在-80℃。取出約50mg前額葉皮層進行實驗研究。

1.4 實時定量PCR

前額葉皮層提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄方法，使用TransGen Biotech公司的TransScriptTM First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（AT301）合成 cDNA，進行 Quantitative Real Time PCR（采用Takara公司的 SYBR Premix Ex TaqTM）。CRF、CRFR1、GRK3、β-Arrestin1和18S熒光定量PCR引物如下（表1）。經(jīng)過Q-PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)以下引物反應(yīng)之后電泳條帶沒有雜帶，融解曲線較好。

Tab.1 Sequences of Primers for PCR

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 15.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 低氧誘導(dǎo)大鼠大腦前額葉皮層CRF基因表達改變

急性7 km低氧8 h可以增加大鼠大腦前額葉皮層CRF mRNA表達（P＜0.05），7 km低氧 24 h CRFmRNA表達和對照組相比沒有顯著性差異；而5 km慢性連續(xù)低氧5 d和15 d后，CRFmRNA基因表達與對照組比較無明顯差異（圖1）。

2.2 低氧誘導(dǎo)大鼠大腦前額葉皮層CRFR1基因表達改變

急性7 km低氧8 h可以增加大鼠大腦前額葉皮層CRFR1mRNA表達（P＜0.001），7 km低氧 24 h，CRFR1 mRNA表達明顯減少（P＜0.05）；而5 km慢性連續(xù)低氧5 d和15 d后，CRFR1mRNA基因表達恢復(fù)到對照水平，與對照組比較無明顯差異（圖 2）。

2.3 低氧誘導(dǎo)大鼠大腦前額葉皮層GRK3基因表達改變

急性7 km低氧8 h可以增加大鼠大腦前額葉皮層GRK3 mRNA表達（P＜0.05），而 7 km低氧 24 h，GRK3 mRNA表達明顯減少（P＜0.05）；5 km慢性連續(xù)低氧5 d明顯降低GRK3 mRNA表達（P＜0.05），而連續(xù)低氧15 d后，GRK3mRNA表達恢復(fù)對照組水平（圖3）。

2.4 低氧誘導(dǎo)大鼠大腦前額葉皮層β-Arrestin1基因表達改變

急性7 km低氧8 h后大鼠大腦前額葉皮層β-Arrestin1 mRNA表達明顯減少（P＜0.05），7 km低氧24 h后β-Arrestin1 mRNA表達沒有差異；5 km慢性連續(xù)低氧5 d后，β-Arrestin1 mRNA表達仍沒有差異，而連續(xù)低氧15 d后β-Arrestin1 mRNA表達明顯升高（P＜0.05，圖 4）。

Fig.1 Effectsofhypoxia on ratCRFmRNA in cortex（±s，n＝6）

Fig.2 Effects of hypoxia on rat CRFR1 mRNA in cortex（±s，n＝6）

Fig.3 Effects of hypoxia on ratGRK3mRNA in cortex（±s，n＝6）

Fig.4 Effects of hypoxia on ratβ-Arrestin1mRNA in cortex（±s，n＝6）

3 討論

低氧通過HPA軸引起機體神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫、自主神經(jīng)功能以及行為反應(yīng)改變。我們實驗室已經(jīng)報道低氧激活HPA軸，促進下丘腦PVN區(qū)、正中隆起ME以及杏仁核處CRF分泌。低氧應(yīng)激后，HPA軸活性增強，血漿ACTH和皮質(zhì)酮水平也顯著升高，CRFR1在低氧應(yīng)激過程中發(fā)揮重要的作用，注射CRFR1拮抗劑后，這些作用不同程度地被阻斷，表明CRFR1是低氧應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中心［5］。我們發(fā)現(xiàn)暴露于慢性連續(xù)低氧后HPA軸活性降低，機體反應(yīng)性也下降。本實驗的研究結(jié)果顯示，急性低氧7km 8 h上調(diào) CRF、CRFR1和GRK3基因表達，而7 km 24 h嚴(yán)重低氧抑制CRFR1和GRK3基因表達。以上結(jié)果提示，在急性低氧下CRF和CRFR1的表達增加有相同的趨勢。在急性低氧下，應(yīng)激早期雖然GRK3表達增多，但是 CRF和 CRFR1表達增加，以及β-Arrestin1表達下降，HPA軸功能仍處于激活狀態(tài)，機體充分展示出在急性低氧應(yīng)激后的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的快速反應(yīng)調(diào)節(jié)。

在暴露于慢性連續(xù)低氧應(yīng)激后，β-Arrestin1mRNA表達上調(diào)，而CRFR1基因表達明顯下調(diào)。我們推測GRK3使激活的CRFR1上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化，并結(jié)合成復(fù)合物，然后β-Arrestin1與該復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致G蛋白不能與CRFR1偶聯(lián)，發(fā)生了脫敏反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)CRFR1內(nèi)在化。β-Arrestin1在急性低氧下的降低和慢性連續(xù)低氧應(yīng)激下的升高提示了β-Arrestin1對慢性低氧下CRFR1脫敏的重要作用。在慢性連續(xù)低氧后，機體CRF分泌減少，及GRK3mRNA表達水平逐漸恢復(fù)對照組水平，同時參與受體脫敏的β-Arrestin1 mRNA顯著增加的共同作用可能使CRFR1發(fā)生內(nèi)在化，提示β-Arrestin1參與了慢性連續(xù)低氧下CRFR1脫敏和內(nèi)吞。

急性低氧CRF和CRFR1表達增加，HPA軸功能激活，機體充分展示出急性低氧應(yīng)激后的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的快速反應(yīng)調(diào)節(jié)。而在慢性連續(xù)低氧后，CRF分泌減少，β-Arrestin1增加使CRFR1內(nèi)在化，提示β-Arrestin1參與了CRFR1脫敏和內(nèi)吞，這可能是慢性低氧適應(yīng)性的機制之一。

【參考文獻】

［1］ De Souza EB.Corticotropin-releasing factor receptors：physiology，pharmacology，biochemistry and role in central nervous system and immune disorders［J］.Psychoneuroendocrinol，1995，20（8）：789-819.

［2］ Wang TY，Chen XQ，Du JZ，etal.Corticotropin-releasing factor receptor type 1 and 2mRNA expression in the ratanterior pituitary ismodulated by intermittent hypoxia，cold and restraint［J］.Neurosci，2004，128（1）：111-119.

［3］ Gurevich V V，Gurevich E V.The structural basis of arrestin mediated regulation of G protein coupled receptors［J］.PharmacolTher，2006，110（3）：465-502.

［4］ Dautzenberg FM，Braun S，Hauger R L.GRK3mediates desensitization of CRF1 receptors：a potentialmechanism regulating stress adaptation［J］.AmJPhysiolRegulIntegrComp Physiol，2001，280（4）：R935-946.

［5］ Xu JF，Chen XQ，Du JZ，etal.CRF receptor type 1mediates continual hypoxia-induced CRF peptide and CRFmRNA expression increase in hypothalamic PVN of rats［J］.Peptides，2005，26（4）：639-646.