陳梅梅 袁 磊 高 梅 劉曉庚施榮華 朱 洵 解海龍 苗紅瑩

（南京財經(jīng)大學圖書館室1，南京 210046）

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院2，南京 210046）

（江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室3，南京 210046）

離子液體是在室溫或接近室溫下以液體狀態(tài)存在的有機熔融鹽，它完全由離子組成［1］，其具有不易揮發(fā)、穩(wěn)定性高、溶解能力強、功能可調(diào)節(jié)等優(yōu)點，應用領(lǐng)域從開始的化學合成發(fā)展到今天的材料科學、環(huán)境科學、分析測試、生物催化等領(lǐng)域［2－4］。

已有不少文獻報道了離子液體可形成雙水相體系，且該體系在萃取分離領(lǐng)域表現(xiàn)出優(yōu)異的性能［5］。Jiang等［6］利用離子液體雙水相分離了青霉素；Ana等［7］用離子液體雙水相提取分離了香蘭素；豆甲立等［8］研究了陽離子表面活性劑／離子液體／水三元體系20℃時的相圖，并用其成功提取分離了辣椒色素；邱祖民等［9］研究了PMBP縮2－ABT與中性磷類提取劑磷酸三丁酯（TBP）在離子液體雙水相體系中對稀土離子的萃取行為。對于該體系在蛋白質(zhì)提取分離方面的應用與作用機制，在初步研究基礎(chǔ)上［10］，本試驗探討了親水性離子液體［Bmim］Cl和K2HPO4形成上相富集離子液體和下相富集磷酸鹽的雙水相體系的成相規(guī)律，并對菜籽粕中蛋白質(zhì)進行了提取研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

菜籽蛋白（由低溫菜籽粕用酶法提取制得［11］，經(jīng)Kjeldahl法測得蛋白質(zhì)量分數(shù)76.5%）：自制品；1－丁基－3－甲基咪唑氯鹽（［Bmim］Cl）、1－烯丙基－3－甲基咪唑氯鹽（［Amim］Cl）、1－乙基吡啶溴鹽（［Epy］Br）（純度均 ＞99%）：中科院蘭州物理化學研究所；Commassie Blue Staining G－250溶液、Britton－Robinson（B.R）緩沖溶液：均按常規(guī)方法配制；K2HPO4等化學試劑均為分析純：水：自制純水。

722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；pHs－3C型精密酸度計：上海雷磁儀器廠；THZD臺式恒溫振蕩器：太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；SL1202型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 相圖的繪制［12］

溶解度測定：在30℃恒溫下，首先稱取一定量的K2HPO4（m1）于燒杯中，加蒸餾水溶解，然后加入一定量的離子液體（m2），直至混合溶液恰好出現(xiàn)渾濁，稱量（m總），即可得到各組分的質(zhì)量分數(shù)，再加蒸餾水至澄清，如此循環(huán)數(shù)次后得到溶解度曲線，用經(jīng)驗方程關(guān)聯(lián)K2HPO4質(zhì)量分數(shù)與離子液體質(zhì)量分數(shù)的關(guān)系，并繪制相圖。

相平衡數(shù)據(jù)測定：以三角形相圖為指導，選取大致合適當系統(tǒng)點配制溶液。于15 mL刻度試管中，加入一定量的離子液體，再加入一定量K2HPO4水溶液，定容至刻度，振蕩搖勻60 min，放置2 h，待溶液分相完全，分別測得上、下相溶液的密度及K2HPO4的質(zhì)量（用磷鉬藍分光光度法［13］測得），得到上、下相中K2HPO4的質(zhì)量分數(shù)；利用溶解度曲線的經(jīng)驗關(guān)聯(lián)方程由K2HPO4質(zhì)量分數(shù)算得離子液體的質(zhì)量分數(shù)，從而得到上、下相中各組分的質(zhì)量分數(shù)，即為雙水相液－液相平衡數(shù)據(jù)。

1.2.2 離子液體雙水相提取菜籽蛋白

在10 mL刻度比色管中加入3.000 g的離子液體，0.800 g的K2HPO4，一定量的菜籽蛋白溶液，在研究酸度影響時再加入不同pH值的B.R緩沖溶液1.00 mL，用二次水稀釋到8.00 mL。200 r／min恒溫震蕩20 min，放置30 min，分相清晰后，取上相溶液用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)的含量，按下式計算菜籽蛋白的提取率（E）及分配比（D，為避免相比（上下兩相液體的體積比）的影響而選定分配比為兩相蛋白質(zhì)質(zhì)量比）。上相離子液體可通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥過夜等簡單處理后重復使用。

蛋白質(zhì)提取率＝（上相蛋白質(zhì)質(zhì)量／加入的總蛋白量）×100%

分配比＝上相蛋白質(zhì)總質(zhì)量／下相蛋白質(zhì)總質(zhì)量

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析方法

相圖采用Origin8.0軟件繪制并用經(jīng)驗法進行分析；其他數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件處理并用直觀分析法和方差分析法進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ［Bmim］Cl／K2 HPO4雙水相系統(tǒng)相圖

2.1.1 溶解度曲線及相圖

按1.2.1方法測得30℃時［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O體系的數(shù)據(jù)用1.2.3方法繪得相圖如圖1所示。在此三角相圖中，溶解度曲線的兩個端點A和B表示［Bmim］Cl＋K2HPO4＋水的飽和溶液，A點為［Bmim］Cl飽和水溶液，B點K2HPO4飽和水溶液，而點 M和點 N則分別表示［Bmim］Cl和K2HPO4水的飽和溶解度。連接 PQ，PM，QN，AP，AQ將相圖分為五個區(qū)域：其中Ⅰ區(qū)域為K2HPO4＋［Bmim］Cl＋H2O不飽和溶液的單相區(qū)；Ⅱ區(qū)域為雙水相區(qū)上相為離子液體相，主要含有大量的［Bmim］Cl及少量的K2HPO4和水，而下相為水相，主要為大量的水和K2HPO4及少量的［Bmim］Cl；Ⅲ區(qū)域為［Bmim］Cl＋K2HPO4＋兩個水飽和溶液（P和Q）與［Bmim］Cl固體（A）的三相區(qū)；Ⅳ區(qū)域為［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O的飽和溶液（Q）、K2HPO4的飽和水溶液（N）與［Bmim］Cl固體（A）的三相區(qū)；Ⅴ為［Bmim］Cl飽和水溶液（M）、［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O飽和溶液與［Bmim］Cl固體（A）的三相區(qū)。試驗結(jié)果可知，［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O系形成雙水相，質(zhì)量分數(shù)范圍：［Bmim］Cl為5.16%～63.74%，K2HPO4為4.48%～76.72%，H2O為18.12%～60.88%。

圖1 30℃［Bmim］Cl＋K2 HPO4＋H2 O三元體系相圖

2.1.2 溫度對相圖的影響

按1.2.1方法測得不同溫度下［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元體系相圖，如圖2所示。由圖2可知，隨溫度從30℃升高到60℃，溶解度曲線向內(nèi)收縮，上相的離子液體相所占比例逐漸下降，這表明高溫使雙水相區(qū)的離子液體相體積縮小，相比明顯降低，對雙水相的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的提取不利。為使離子液體雙水相對菜籽粕蛋白的穩(wěn)定且良好的提取效果，故本試驗的離子液體雙水相體系提取分離菜籽蛋白時溫度選用30℃。

圖2 不同溫度［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元體系相圖的影響

2.1.3 溶解度曲線的關(guān)聯(lián)

按1.2.1的濁度法測得30℃時［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O體系中上、下相［Bmim］Cl、K2HPO4溶解情況，結(jié)果如圖3和圖4所示；又用Origin8.0軟件對其進行非線性回歸，結(jié)果得到上、下相的K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)的方程為式（1）、（2）。從相關(guān)系數(shù)看，在該體系的上、下相中K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)有極高的關(guān)聯(lián)精度，也說明兩方程式的表述是可靠的。

圖3 上相K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)的關(guān)系

圖4 下相K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)的關(guān)系

2.2 離子液體雙水相提取菜籽蛋白

2.2.1 離子液體對體系成相及菜籽蛋白提取率的影響

分別用［Amim］Cl、［Bmim］Cl和［Epy］Br等離子液體與K2HPO4形成雙水相體系提取菜籽蛋白，其中［Bmim］Cl的提取率最高（≥98%），且用量少，成相明顯，故試驗中選用［Bmim］Cl作為成相的離子液體。

在只改變［Bmim］Cl加入量下按試驗方法試驗，考察［Bmim］Cl加入量對菜籽蛋白提取率的影響。從圖5表明，當離子液體質(zhì)量濃度＜250mg／mL時，溶液不成相；當離子液體質(zhì)量濃度≥250mg／mL時，隨著離子液體濃度的增大，相比逐漸增大，菜籽蛋白的分配系數(shù)也增大，其提取率也同時增大。當離子液體質(zhì)量濃度低于350mg／mL時，隨著離子液體質(zhì)量濃度的增大，提取率逐漸增大；當在350～400 mg／mL之間時趨于一定，提取率也達到最大（＞98%）；當大于400mg／mL時，離子液體濃度過高，體積排阻效應增大導致菜籽蛋白在相間的傳遞和在相中的擴散阻力大大增加，不利于蛋白質(zhì)進入離子液體相，提取率明顯降低。綜合考慮，試驗中離子液質(zhì)量濃度選為350mg／mL。

圖5 ［Bmim］Cl質(zhì)量濃度對提取率和分配比的影響

2.2.2 鹽對體系成相及菜籽蛋白提取率的影響

按1.2.2方法，進行鹽的單因素考察試驗，結(jié)果如圖6。從圖6可知，當K2HPO4質(zhì)量濃度＜100mg／L時，溶液不成相；當K2HPO4質(zhì)量濃度≥100mg／L時，形成雙水相，且隨著鹽量的增加，相比逐漸減小。蛋白質(zhì)提取率在體系不形成雙水相前幾乎不變化，形成雙水相后迅速達到最高峰，然后隨鹽量的增加由于相比和分配比都呈逐漸減小趨勢，而使提取率呈現(xiàn)逐漸下降，且下降速率幾乎恒定。其原因是：鹽量太少體系不成相或提取不完全，當K2HPO4質(zhì)量濃度達150mg／L時提取率最大（≥99%），鹽的質(zhì)量濃度超過150 mg／L后提取率又有所減??；這可能是鹽的濃度過大，對蛋白質(zhì)產(chǎn)生的鹽效應起主要作用，影響了離子液與菜籽蛋白作用的穩(wěn)定性，從而降低蛋白質(zhì)的提取率。

圖6 K2 HPO4濃度對提取率和分配比的影響

2.2.3 蛋白質(zhì)濃度對體系成相和提取率的影響

按1.2.2方法，進行蛋白質(zhì)濃度的單因素考察試驗，結(jié)果如圖7。從圖7可知，當菜籽蛋白質(zhì)量濃度低于75.0 mg／L時，蛋白質(zhì)的提取率隨蛋白質(zhì)濃度增大而增大；當菜籽蛋白質(zhì)量濃度在65.0～110 mg／L之間時，提取率變化趨于基本平穩(wěn)，但稍有下降；當菜籽蛋白濃度大于110 mg／L，提取率呈明顯下降趨勢。

圖7 菜籽蛋白濃度對提取率和分配比的影響

2.2.4 pH值對體系成相和菜籽蛋白提取率的影響

按1.2.2方法，進行不同pH值的B.R緩沖溶液的單因素考察試驗，結(jié)果如圖8。從圖8可知，溶液pH值在4～7時菜籽蛋白提取效果好。pH值＞7或pH值＜4，菜籽蛋白提取率均呈下降趨勢，且酸性條件下的下降趨勢顯著大于堿性。其原因是：蛋白質(zhì)與離子液體之間的作用力主要為靜電作用和氫鍵作用［10］，菜籽蛋白等電點為3.5，在等電點及附近離子液體與蛋白質(zhì)間主要靠氫鍵作用，隨著pH值減小，蛋白質(zhì)帶正電荷越明顯，與離子液體陽離子間排斥作用增強，從而使提取率降低；當溶液pH值在大于等電點的一定范圍內(nèi)時，帶負電荷蛋白質(zhì)增強了與離子液體中陽離子間靜電引力，從而提取率較高。

圖8 溶液pH對提取率和分配比的影響

2.2.5 離子液體雙水相提取菜籽蛋白質(zhì)條件的優(yōu)化

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，在［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O雙水相體系中，選擇［Bmim］Cl濃度、K2HPO4濃度、菜籽蛋白質(zhì)濃度和pH值等4個因素，依據(jù)優(yōu)化理論［14－15］設(shè)計 L16（45）正交試驗來優(yōu)化并確定其最佳工藝條件，其試驗設(shè)計與安排見表1、試驗結(jié)果與分析見表2。

由表2可以看出，經(jīng)極差分析得到所考察的4個因素對菜籽粕蛋白質(zhì)提取影響順序為：K2HPO4濃度＞［Bmim］Cl濃度＞菜籽蛋白濃度＞提取pH值?？梢娫诖颂崛◇w系中鹽（K2HPO4）濃度對其提取蛋白質(zhì)的影響最大，而提取體系的pH值影響最小。方差分析結(jié)果也表明該提取體系中的鹽（K2HPO4）濃度屬極顯著的影響因素，離子液體（［Bmim］Cl）和蛋白質(zhì)濃度屬于顯著的影響因素，pH值為不顯著的影響因素。正交試驗優(yōu)化得到的該離子液體雙水相提取菜籽蛋白的最優(yōu)條件為：K2HPO4質(zhì)量濃度為150 mg／mL、［Bmim］Cl質(zhì)量濃度為 350 mg／mL、菜籽蛋白濃度為70.0 mg／L、pH值為6.8。根據(jù)正交試驗效應指標的估算方法［15］得在最佳條件下的蛋白質(zhì)優(yōu)提取率 Y優(yōu)＝Y(jié)平均＋w1，max＋w2，max＋w3，max＝85.6＋8.63＋7.10＋4.28＝105.6%，出現(xiàn)估算提取率＞100%的原因是試驗過程存在一定的誤差和估算的方法有一定的局限性。進一步的驗證試驗結(jié)果表明，在此最佳條件下菜籽蛋白提取率為99.1%，這與按優(yōu)化理論［15］的估算值（105.6%）雖有6.5%的差值，但還是在試驗允許的誤差范圍內(nèi)，因此認為兩者的結(jié)果還是基本吻合，也反映所設(shè)計的優(yōu)化試驗是科學的，試驗結(jié)果是可靠的。

表1 L16（45）正交試驗的安排

表2 L16（45）正交試驗的結(jié)果及分析（n＝3）

3 結(jié)論

3.1 采用濁度法測定得到［Bmim］Cl和K2HPO4在純水中的溶解度曲線，用回歸法得到溶解度方程具有高度的關(guān)聯(lián)性（相關(guān)系數(shù)均＞0.99），通過繪制的30℃下［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元體系的相圖表明：該體系相圖分為5個相區(qū)：1個不飽和溶液單相區(qū)，1個雙水相區(qū)，3個三相區(qū)；這為利用雙水相體系提取分離蛋白質(zhì)提供了理論和試驗基礎(chǔ)。

3.2 試驗得到30℃時［Bmim］Cl／K2HPO4體系形成雙水相的質(zhì)量分數(shù)范圍為：［Bmim］Cl為5.16%～63.74%，K2HPO4為 4.48%～76.72%，H2O為18.12%～60.88%。這些相行為的信息為進一步開發(fā)［Bmim］Cl／K2HPO4雙水相體系對生物活性物質(zhì)的提取分離提供了指導。

3.3 通過L16（45）正交試驗優(yōu)化得到［Bmim］Cl／K2HPO4離子液體雙水相體系提取菜籽粕中蛋白的最佳提取條件為：K2HPO4質(zhì)量濃度為 150 mg／mL、［Bmim］Cl質(zhì)量濃度為350 mg／mL、菜籽蛋白質(zhì)量濃度為70.0 mg／L、pH值為6.8；且驗證試驗的結(jié)果菜籽蛋白提取率達99.1%，與按優(yōu)化理論的估算值基本吻合。表明優(yōu)化試驗是成功可靠的，為今后進一步研究該體系的放大試驗或規(guī)?；a(chǎn)奠定了相應的試驗基礎(chǔ)。

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