秦西云，盧訓(xùn)，方琦，尹躍艷，丁銘， 張仲凱

1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南農(nóng)業(yè)基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明市學(xué)云路9號 650223；

2云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明市圓通街33號 650031

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬的代表種，該病毒具有較廣的寄主范圍，可侵染包括30個(gè)科的310多種植物[1]。TMV基因組全長6395nt，為單鏈正義RNA，基因組共編碼4個(gè)ORF[2]，其中外殼蛋白基因（coat- protein，CP）是病毒分類相關(guān)基因[3]。在不同的寄主上TMV有許多株系，在我國主要有TMV-U1、TMV-U2、番茄株系、車前草株系、豆類株系、葫蘆科株系和蘭花株系；煙草上的株系主要有TMV-OM、TMV-U1、TMVVulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY[4]。

云南煙草常年種植面積保持在35萬公頃（云南省煙草專賣局；http://www.yn-tobacco.com/templates/ycgsww/gongsijieshao/gongsijieshao.htm）左右，是云南的主要農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來，隨著煙草漂浮育苗技術(shù)的普遍應(yīng)用，由TMV引起的花葉病在煙草上發(fā)生嚴(yán)重，對煙葉品質(zhì)及產(chǎn)量均造成較大影響。本研究通過采集云南煙草種植區(qū)的TMV病樣，對云南不同地區(qū)的TMV外殼蛋白基因進(jìn)行了比較，為TMV的防控及快速檢測方法的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

供試樣品分別于2010至2011年度采集自云南不同煙草種植區(qū)（表1），樣品癥狀表現(xiàn)為花葉、葉片鄒縮、植株矮化等癥狀。

表1 樣品采集信息表

1.1.2 抗體

TMV單克隆抗體由周雪平教授惠贈(zèng)，TMV多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備，羊抗鼠酶標(biāo)抗購自美國Sigma公司。

1.1.3 引物及其他試劑

根據(jù)已報(bào)道的序列(福建分離物，登錄號：AF395127；山西分離物，登錄號：JF920727)，設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增TMVcp基因全序列引物，引物序列為：TMV-CPR：AAGCTTTCAAGTTGCAGGACCAGA(劃 線 處 為HindⅢ 酶 切 位 點(diǎn)) ，TMV-CPF：GGATCCATGTCTTACARTATCAC (劃線處為BamHI酶切位點(diǎn))。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pGEM-T Easy載體購自Promega公司，DNA聚合酶購自TaKaRa，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 TAS-ELISA

在酶標(biāo)板中加入經(jīng)包被緩沖液（Na2CO31.59 g、NaHCO32.93 g溶于1 L蒸餾水，調(diào)pH至9.6）稀釋的TMV多抗血清100 μL/孔，37 ℃培育2.5 h-3 h或4 ℃過夜；用加0.5%吐溫20的磷酸緩沖液（PBST，Nacl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4· 2H2O 2.9g、Kcl 0.2g溶于1 L蒸餾水，調(diào)pH至7.4）洗滌三次。再加入經(jīng)PBST稀釋的樣品材料粗汁液100 μL/孔，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陽性、陰性和空白對照。同樣37 ℃培育2.5 h-3 h或4 ℃過夜；PBST洗滌3次。每孔加封閉液（2%牛血清白蛋白）200 μL。37℃培育0.5 h或4 ℃過夜。之后加入100 μL/孔的經(jīng)PBST稀釋的TMV單克隆抗體，37 ℃培育2.5 h-3 h或4 ℃過夜。PBST洗板三次，加入100 μL/孔的經(jīng)PBST稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)抗體，37 ℃培育2.5 h-3 h或4℃過夜。PBST洗板三次后加入顯色底物室溫顯色。405 nm 讀取OD值，樣品OD值的平均值與陰性對照OD值的平均值的比值≥2.0定義為陽性，否則為陰性。

1.2.2 IC-RT-PCR

TAS-ELISA檢測為陽性的樣品，經(jīng)三次單枯斑摩擦接種心葉煙（Nicotiana Glutinosa）獲取純化單斑分離物。取純化后單枯斑加入50 μL無TMV污染的雙蒸水，充分研磨后，5000 rpm 離心5 min，取上清進(jìn)行免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ICRT-PCR），方法參考尚海麗[5]等。即TMV多抗血清經(jīng)包被緩沖液稀釋1000倍后取50 μL包被PCR管，4℃孵育過夜。棄去包被液，PBST洗滌3次后加入50 μL單枯斑研磨上清液，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以感病樣品和健康樣品做為陽性和陰性對照，37 ℃培育2 h，PBST洗滌3次后用20 μL雙蒸水洗滌1次，取最后一次洗滌加入12.5 μL雙蒸水和1 μL TMV-CPR，70 ℃，10 min后冰浴5 min，再加入4 μL M-MLV RT 5×反應(yīng)緩沖液、1 μL 10mM dNTP、1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和0.5 μL RNA酶抑制劑混勻，42 ℃反應(yīng)90 min。再取5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃ 2 min，94 ℃1 min，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)后；72℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后，每個(gè)分離物挑取5個(gè)陽性克隆進(jìn)行雙向測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 TAS-ELISA結(jié)果

2010至2011年度共采集花葉樣品710份，其中2010年采集380份，檢出TMV陽性樣品349份，陽性檢出率為92%；2011年采集樣品330份，檢出TMV陽性樣品197份，陽性檢出率為50.6%。

2.2 IC-RT-PCR擴(kuò)增TMV cp基因全序列

采用TMVcp基因特異性引物對采自云南不同煙區(qū)的38個(gè)TMV病樣進(jìn)行IC-RT-PCR擴(kuò)增，得到約500 bp的片段，經(jīng)克隆、測序表明，每個(gè)分離物的3個(gè)陽性克隆序列一致，片段大小480 bp，含有完整的TMVcp基因序列。采用DNAMAN 7.0對獲得序列進(jìn)行拼接比對，云南38個(gè)TMV分離物核苷酸相似性在95%～100%之間，氨基酸同源性在97.5%～100%之間。

2.3 云南TMV煙草分離物序列比較

采用MEGA4.0最大簡約法（maximum parsimony,MP）構(gòu)建了云南38個(gè)TMV分離物cp基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），發(fā)現(xiàn)38個(gè)分離物在系統(tǒng)進(jìn)化樹中分為明顯的4個(gè)分支；其中滄源分離物（yunnancangyuan）和鎮(zhèn)雄分離物（yunnan-zhenxiong）各為一支。其余36個(gè)分離物分別聚為兩個(gè)分支，各分支中都有部分分離物完全一致，也有部分分離物之間存在一定差異。

采用DNAMAN Version 7.0對獲得的38個(gè)TMV分離物外殼蛋白氨基酸進(jìn)行比較（表2）發(fā)現(xiàn)，在38個(gè)分離物的氨基酸序列中，有10個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異；據(jù)此差異可將38個(gè)分離物分成12組不同的氨基酸序列（表3）。對這12組序列進(jìn)行比較顯示，差異最大的分離物為昆明宜良分離物（Yunnan-kunming-yiliang）和耿馬分離物（Yunnangengma），它們都有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)與其它分離物不同；其次是昌寧分離物（Yunnan-changning）有兩個(gè)氨基酸的變異，其余分離物只有一個(gè)氨基酸的變異；從氨基酸變異位點(diǎn)比較，變異最多的位點(diǎn)為外殼蛋白氨基酸序列的第13位，有6個(gè)分離物在該位為酪氨酸，其余分離物均為苯丙氨酸，其次是第4位，有4個(gè)分離物的該位氨基酸為天冬酰胺，其余分離物為絲氨酸。

圖1 云南不同地區(qū)的38個(gè)TMV分離物cp基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 云南TMV分離物外殼蛋白基因氨基酸序列差異

表3 38個(gè)分離物分成 12組不同的氨基酸序列

蛋白質(zhì)抗原的決定簇可以由相鄰順序排列的氨基酸殘基構(gòu)成，亦可由空間相互靠近的若干氨基酸殘基構(gòu)成[6]；但不管是哪種，只有分布于蛋白質(zhì)的表面才不需要通過變性來改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象而使其暴露出來，這一點(diǎn)對植物病毒的外殼蛋白至關(guān)重要。驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要?jiǎng)恿碜詾槭贡┞队谌軇┲械氖杷鶊F(tuán)降低至最少程度的需要，但同時(shí)需要保持處于伸展?fàn)顟B(tài)的多肽鏈和周圍水分子之間形成的氫鍵相互作用的有利能量狀態(tài)，為滿足這一條件，多肽鏈將發(fā)生折疊使多數(shù)疏水基團(tuán)避開與溶劑水接觸[7]，即在空間結(jié)構(gòu)上使親水基團(tuán)分布于外表面?；谝陨蟽牲c(diǎn)，采用ProtScale程序?qū)σ陨?2組氨基酸序列分別繪制蛋白質(zhì)的親疏水性序列普發(fā)現(xiàn)，在氨基酸第100位點(diǎn)以前所有序列普都一樣，在氨基酸第100位點(diǎn)以后可分成兩類，即耿馬分離物、鎮(zhèn)康分離物、富民分離物、晉寧分離物、元江分離物為一類（圖2A），騰沖分離物、昌寧分離物、嵩明分離物、昆明宜良分離物、硯山分離物、臨翔分離物和安寧分離物為另一類（圖2B）。

圖2 蛋白子親疏水性序列譜

再利用Swiss-Model Workspace的Alignment Mode分別對昆明宜良分離物和鎮(zhèn)康分離物進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的同源性建模（圖3），發(fā)現(xiàn)兩個(gè)分離物建模的基本模型均為3kmlK(3.01A)，且與模型的同一性分別為97.802%和98.901%。

2. 4 云南TMV煙草分離物與不同寄主TMV分離物cp基因的比較

將云南獲得的38個(gè)TMV分離物與已報(bào)道的TMV分離物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，38個(gè)分離物與TMV-U1株系同源性最高，在97.1%-99.6%之間，而與TMV中國株系同源性僅為74%。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果也顯示38個(gè)TMV云南煙草分離物與TMV-U1株系、TMV福建分離物（TMV-Fujian-017、TMV-Fujian-152、TMV-Fujian）聚為一支（圖4）。

圖3 TMV外殼蛋白質(zhì)的同源性建模比較圖

圖4 根據(jù)中國不同TMV分離物構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

目前，TMV株系劃分的方法有三種，一是傳統(tǒng)的生物學(xué)方法，它根據(jù)病毒在寄主植物上的癥狀和病毒的寄主范圍來劃分株系[4]。二是血清學(xué)方法，張成良等[8]就報(bào)道過單克隆抗體劃分TMV株系的方法。三是核酸序列相似性分析法，雷彩燕[4]又指出核苷酸同源性雖然是進(jìn)行株系劃分的有效依據(jù)，但對于TMV株系間核苷酸序列或氨基酸序列同源性低于多少為不同的株系沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。丁銘等[9]報(bào)道了云南五個(gè)分離物與TMV-U1株CP核苷酸和氨基酸序列同源性分別達(dá)94.5%和97.5%以上，從而將云南五個(gè)分離物歸屬為TMV-U1株。

本研究通過對云南38個(gè)TMV煙草分離物的cp基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，38個(gè)分離物的核苷酸序列相似性在95%～100%之間，氨基酸同源性在97.5%～100%之間；比較38個(gè)TMV分離物與已報(bào)道的TMV分離物發(fā)現(xiàn)，云南38個(gè)分離物與TMV-U1株系同源性最高，達(dá)到97.1%-99.6%，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系也顯示云南不同分離物與TMV-U1株系、TMV福建分離物聚為一支。根據(jù)丁銘等[9]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，本研究的38個(gè)分離物歸屬為TMV-U1株系，但云南38個(gè)分離物間也存在一定差異。這一研究結(jié)果與謝揚(yáng)軍[10]和宋麗云[11]的一致，宋麗云的研究結(jié)果顯示TMV的種群遺傳結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定，基因組序列變異較少，而謝揚(yáng)軍解釋各分離物之間的差異，是由于TMV主要以點(diǎn)突變的方式來適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境帶來的選擇壓力而造成的。

以38個(gè)分離物在氨基酸序列上的差異將其分成12組；再分別繪制12組蛋白質(zhì)親疏水性序列普，發(fā)現(xiàn)12組序列普分成兩類；又分類進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的同源性建模，結(jié)果顯示，兩類蛋白質(zhì)建模的基本模型均為3kmlK(3.01A)，且與模型的同一性分別為97.802%和98.901%，因此可判斷兩類蛋白質(zhì)為同一空間結(jié)構(gòu)的蛋白。據(jù)此可推斷，云南各地?zé)煵萆蟃MV的外殼蛋白在空間結(jié)構(gòu)上一致，其免疫原特性沒有差異，可通過制備一個(gè)分離物的特異性抗體用于不同區(qū)域病毒的檢測。

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