賈曉娟，黃力勤，劉文軍

中國科學院微生物研究所中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2012年1月20日，國際知名學術(shù)期刊Nature 和Science 同時發(fā)表了一份聯(lián)合聲明：39位流感研究者聲明在60 d 內(nèi)暫停實驗室突變H5N1禽流感病毒的研究工作。這一聲明引發(fā)了科研工作者對實驗室重構(gòu)流感病毒潛在的生物安全問題的重視和思考。我們尊重和鼓勵科學家利用重構(gòu)流感病毒的方法探索其致病機理，但也應(yīng)高度重視重構(gòu)流感病毒潛在的生物風險[1-2]，應(yīng)當對重構(gòu)病毒的生物安全和防范措施進行風險評估，并權(quán)衡相關(guān)研究的科學意義和社會價值。

1 流感病毒簡介

流感病毒是一種造成人及動物患流行性感冒的RNA 病毒，在分類學上屬于正黏病毒科，根據(jù)其內(nèi)部核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原性不同，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中甲型流感病毒在禽類和哺乳動物中廣泛存在，也是目前引起人類和各種動物流感的主型。甲型流感病毒根據(jù)血凝素(Hemagglutinin,H)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,N)抗原不同，又分為許多亞型，H 可分為15個亞型(H1～H15)，N 分為9個亞型(N1～N9)，其中僅H1N1和H3N2主要感染人類，其他許多亞型的自然宿主是多種禽類和動物，其中對禽類危害最大的是H5、H7和H9亞型毒株。甲型流感病毒基因組有8個RNA 片段構(gòu)成，它們編碼了14個病毒蛋白：聚合酶蛋白(PB1、PB2和PA)[3-4]、核蛋白(NP)、血凝素蛋白(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和 M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)、核輸出蛋白(NEP)，以及最近報道的PB1-F2、PB1-N40、PA-X 和M42蛋白[3-6]。

流感病毒會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速傳播，引發(fā)世界各地周期性的大流行。每年世界范圍內(nèi)因季節(jié)性流感導致的死亡人數(shù)約超過5萬人[7]。除季節(jié)性流感外，廣泛流行的流感病毒株可以在短時間內(nèi)造成全球性感染，例如，1918年的西班牙大流感，兩年之內(nèi)導致全球超過5000萬人死亡[8]；2009年暴發(fā)的H1N1大流感感染量超過2000萬人。一些流感病毒可以通過跨種間傳播感染人類，最典型的是亞洲禽流感病毒 H5N1和今年新發(fā)現(xiàn)的H7N9。其中，H5N1雖具有極高的致死率(約占感染者的56%)，但卻不能在人群中有效傳播，2003?2006年，全球僅有263例感染病例[9]。2013年3月底，我國出現(xiàn)的H7N9流感病毒是由來自東亞地區(qū)的野鳥和中國上海、浙江、江蘇雞群的流感病毒基因重組產(chǎn)生的[10]。截至2013年5月6日，我國內(nèi)地已確診H7N9感染病例129例，其中31人死亡。

甲型流感病毒含有的8個基因片段極易發(fā)生突變和重組，這是新型流感病毒的產(chǎn)生和跨種間傳播的主要原因。基因突變?nèi)菀自斐闪鞲胁《綡A 和NA 蛋白抗原性變化，即抗原飄移，基因突變造成流感病毒變異的程度較?。欢蛑亟M會使流感病毒的表面抗原發(fā)生根本轉(zhuǎn)換，即抗原轉(zhuǎn)換?；蛑亟M會產(chǎn)生新型流感病毒，這也是流感病毒跨種間傳播以及導致感染不可預測和反復持續(xù)的主要原因。

2 流感病毒的實驗室重構(gòu)

為了探索流感病毒跨種間傳播的分子機制以及影響流感病毒感染力和致病力的分子機理，科學家采用反向遺傳操作技術(shù)在實驗室模擬自然環(huán)境中流感病毒基因重組的過程構(gòu)建出新型流感病毒。他們希望借助這一研究手段揭示流感病毒跨種間感染機理和不同亞型流感病毒感染力和致病力存在巨大差異的原因。目前國內(nèi)外實驗室重構(gòu)流感病毒的研究工作主要是對H5型病毒進行重構(gòu)實驗，目前世界上幾個實驗室已經(jīng)構(gòu)建出了可以在哺乳動物傳播的 H5型流感病毒[11-13]，這對于揭示H5型流感病毒跨種間傳播的分子機制以及對流感病毒的預防和控制具有重要意義。

2011年底，荷蘭伊拉斯姆斯大學醫(yī)學中心(Erasmus Medical Center)的榮·費奇(Ron Fouchier)及其同事向Science 雜志提交了一份研究論文，文章指出他們在實驗室里對禽流感病毒H5N1只需進行5次基因的人工變異，便可以使之具有在哺乳動物雪貂間傳播的易感性[11]。這5種變異此前已經(jīng)分別在自然界中獨立觀察到過。無獨有偶，2012年，美國威斯康星大學麥迪遜分校的河岡義裕(Yoshiro Kawaoka)及其同事也在另一本權(quán)威科學雜志——Nature 發(fā)表了一篇文章，報告了類似的研究結(jié)果[12]。2013年5月，Zhang 等在Science 雜志上發(fā)表了將H5N1型和H1N1型流感毒株進行基因重配的文章[13]，其研究是通過將H5N1型流感病毒與2009年引發(fā)大流感的H1N1型流感病毒進行基因重配，包裝出127株重構(gòu)流感毒株，研究介紹了人工重構(gòu)病毒的傳播能力，并希望以此研發(fā)新型抗流感病毒疫苗。

上述研究成果對于闡明流感病毒跨種間傳播的分子機制以及不同病毒感染力和致病力差異的分子機理具有重要意義，但重構(gòu)病毒潛在的風險危害也令人擔憂。這些重構(gòu)毒株在鑒定為無害或確定安全等級之前，都存在著可預見或潛在的生物風險因素，如：某些基因毒株或基因片段帶有致病基因、抗藥基因等，倘若實驗者缺乏足夠的安全意識使之進入到環(huán)境中，一旦在外界環(huán)境中發(fā)生突變或與環(huán)境中的物種發(fā)生基因重組等，便很可能造成嚴重的生物災(zāi)害。這一擔憂在上述榮·費奇和河岡義裕兩個研究小組公布研究成果后更是達到了頂峰。他們的研究引起了科學界和社會的巨大恐慌，人們不禁思索這是否意味著可以通過實驗室基因重組的方法構(gòu)造出新的流感病毒？實驗重構(gòu)的流感病毒如何處置？現(xiàn)有的生物安全防護條件和科研管理是否可以有效防控重構(gòu)流感病毒的擴散？

2012年2月，世界衛(wèi)生組織在日內(nèi)瓦召開了一個閉門會議，包括榮·費奇和河岡義裕兩名科研成果處于爭議的科學家在內(nèi)的22名來自科學界和出版界的專家參加了此會。會議最后決定暫停流感病毒相關(guān)研究60 d，以給科學家和生物安全管理者足夠的時間辯論，確定如何能在保障生物安全的前提下持續(xù)此類研究，實驗室采取哪些措施能避免重構(gòu)病毒的生物危害[14]。

3 實驗室重構(gòu)流感病毒的生物安全防護

科學界和公眾對實驗室重構(gòu)流感病毒的恐懼和擔憂主要表現(xiàn)為以下5點：1)重構(gòu)出的流感病毒是否具有更高的感染性和致病力，是否潛在生物危害？2)重構(gòu)的流感病毒是否會從實驗室傳播到自然環(huán)境，導致流感的大暴發(fā)？3)從事重構(gòu)流感病毒工作的科研工作者是否具有生物安全層面的職業(yè)操守和自律意識？4)如何防止恐怖分子利用公開發(fā)表的實驗數(shù)據(jù)制造出新型病毒危害社會？5)國外研究者是否會質(zhì)疑此類研究屬于“生物戰(zhàn)劑”的研制范疇，從而阻礙其他相關(guān)科研項目的順利開展？因此，科學家和科研管理者有必要在實驗室重構(gòu)流感病毒項目立項前，權(quán)衡其研究的科學意義和風險危害，并確保批示項目具備完善的生物安全保障體系。目前國內(nèi)外主要從實驗室防護和制度管理兩方面保障實驗室重構(gòu)流感病毒的安全防護體系[15]，本文將對此兩方面提出相關(guān)建議。

3.1 重構(gòu)流感病毒的實驗室防護

3.1.1 加強重組流感病毒實驗活動的風險評估

建議對實驗室重構(gòu)流感病毒的實驗活動在實驗操作、重構(gòu)毒株、儀器設(shè)備、管理制度等方面均進行動態(tài)的生物危害風險評估。根據(jù)我國《病原微生物實驗室生物安全管理條例》(國務(wù)院第424號令)、《人間傳染的病原微生物名錄》、《重組DNA 實驗管理條例》等相關(guān)條例、要求確定原始毒株和重組毒株的危害等級，并按規(guī)定選擇在相應(yīng)等級的生物安全實驗室開展實驗活動。對實驗室重構(gòu)流感病毒的實驗活動進行生物危害風險評估主要基于以下3個原因：

1)流感病毒中有些毒株屬于高致病性病原微生物，例如：H5N1禽流感病毒屬于甲型流感病毒的一個高致病型亞型，按照《人間傳染的病原微生物名錄》劃分，屬于危害等級為二類的病原微生物，具有跨種間傳播特性，可導致人和動物患病，且有很高的致死率，因此其相關(guān)重組實驗均具有一定的生物風險；2)流感病毒是一種經(jīng)空氣傳播感染呼吸道的病毒，在實驗操作中病毒極易擴散到空氣中，存在潛在重構(gòu)流感病毒向自然環(huán)境擴散甚至感染人類的生物風險；3)重構(gòu)流感病毒可能產(chǎn)生新型耐藥株和強毒株[16]，而目前缺少對重構(gòu)毒株防控和感染治療的有效手段，比如：現(xiàn)有人用H5N1禽流感疫苗不能保證對所有實驗操作人員均具有很好的免疫保護效果，且對重組毒株的免疫效果未知。

3.1.2 加強實驗室重組流感病毒的等級防護

實驗室重構(gòu)流感病毒的出發(fā)毒株常為從感染病例中分離得到的野生型毒株，基于野生型流感病毒與重構(gòu)后病毒的差異以及對重構(gòu)病毒感染性和致病力的未知，建議在生物安全三級以上實驗室中從事流感病毒的重構(gòu)實驗。生物安全四級實驗室的實驗室結(jié)構(gòu)、設(shè)備設(shè)施、安全操作規(guī)程等安全體系適用于對人體具有高度危險性、通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明、目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。比如：重構(gòu)H5N1流感病毒具有人與人之間傳播的可能性，結(jié)合H5N1的高致死率，一旦發(fā)生病毒泄露，會造成大量的人員死亡，而生物安全四級實驗室相比三級實驗室有著更安全的防護設(shè)施[17-18]，如：實驗人員需要穿戴正壓服，同時需要進行更嚴格的消毒滅菌等，這些設(shè)施最大程度地保證了對重構(gòu)病毒的安全防護，但僅有設(shè)備和系統(tǒng)上的防護對于保障整個實驗活動的安全體系也是遠遠不足的。2004年下半年臺灣和新加坡先后發(fā)生急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)實驗室感染事件[19]；據(jù)美國國家研究委員會統(tǒng)計，2003?2009年，美國的生物安全實驗室共發(fā)生過395起生物安全事故，其中7起事故源于實驗室改造生物的泄露。因此，我們建議在加強實驗室重構(gòu)流感病毒的防護工作時，也應(yīng)注意提高相關(guān)科研工作者生物安全層面的防范意識和自律意識[20-23]。

當然，可能目前我們對實驗室重構(gòu)流感病毒的恐懼是多余的，這種過分擔憂在歷史上也曾發(fā)生，如1979年，單純皰疹病毒的胸苷激酶基因克隆實驗要求必須在生物安全四級實驗室中進行，因為當時認為這一實驗具有很高的潛在生物危害，現(xiàn)在我們明白這一危險是不存在的[24]，同樣的實驗現(xiàn)在生物安全一級實驗室就可以進行。所以，未來我們可能獲得預防和治療流感更有效的方法，重構(gòu)流感病毒實驗也無需在高等級的生物安全實驗室中進行，但基于目前研究的未知現(xiàn)狀，我們還是應(yīng)當從意識和行動上加強對流感病毒重構(gòu)實驗的生物安全防護。

3.2 實驗室重構(gòu)流感病毒的生物安全管理防護

實驗室重構(gòu)流感病毒研究結(jié)果的公開發(fā)表具有被恐怖分子參考利用制造生物恐怖事件的潛在風險。因此，國際社會有必要制定出一套行之有效的管理和防范措施健全實驗室重構(gòu)病毒的生物安全管理體系。

早在1992年，我國作為第一批締約方簽署了聯(lián)合國《生物多樣性公約》，在此框架下，于2000年通過了《卡塔特生物安全議定書》，表明要與世界各國共同致力于國際生物安全的管理工作[25]。之后，為了加強病原微生物生物安全領(lǐng)域的學術(shù)和技術(shù)交流，保障安全有效地從事病原微生物相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，各個國家相繼成立了生物安全委員會，并積極舉辦和參與國際性、區(qū)域性生物安全協(xié)會的交流活動。我國也于1979年和2012年分別成立了中國微生物學會病毒學專業(yè)委員會和微生物生物安全專業(yè)委員會，這標志著我國病原微生物生物安全工作進入了一個嶄新階段。目前我國已制定和頒布了《中華人民共和國傳染病防治法》、《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《基因工程安全管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī)，對實驗室生物安全的防護和管理提出了要求，但這些法律法規(guī)的實施和可操作性有待進一步加強?！痘蚬こ贪踩芾磙k法》于1993年12月發(fā)布實施，至今已近20年。此間，生物技術(shù)飛速發(fā)展，其涉及的基因工程范圍、深度及生物安全問題發(fā)生了明顯改變，人們對生物安全的認識亦在不斷加深，隨著重組基因技術(shù)的日趨發(fā)展和完善，重組病毒帶來的生物安全問題可能越來越多、越來越復雜，這就需要建立和健全一套行之有效的生物安全管理和監(jiān)督制約制度，而目前我國基因重組相關(guān)的法律法規(guī)缺少可操作性，其中所提出的生物安全風險評估、項目申報和審批等重要內(nèi)容，尚未具體落實，這就亟需政府和社會各階層統(tǒng)一行動，盡快修訂和完善《基因工程管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī)，落實和加強實驗室生物安全管理。本文從建立和健全相關(guān)法律法規(guī)、基因工程項目審批、生物安全組織管理模式、提高科研人員和公眾生物安全意識4方面提出建議。

1)建議成立或組織專門機構(gòu)負責基因工程生物制品的研究和生產(chǎn)中生物安全有關(guān)規(guī)定、實施細則的制定、完善和及時更新；建議加強法律和公約約束，要求從事實驗室重組病毒研究的科研工作者履行相應(yīng)的生物安全國際公約，并在開展實驗前簽署相關(guān)協(xié)議并發(fā)表生物安全聲明。

2)建議設(shè)立組織機構(gòu)對實驗室重構(gòu)病毒研究項目進行立項前的生物安全審查、審批，要求涉及基因重組的科研課題必須在項目準入前盡可能全面地提供生物風險評估報告、實驗標準操作規(guī)程、應(yīng)急預案及防控措施等，并由該組織機構(gòu)進行初評。

3)建議加強科教文衛(wèi)農(nóng)等相關(guān)部門生物安全管理的溝通與合作，避免“管理斷層”，同時整合社會各階層生物安全管理的優(yōu)勢資源，將流感研究的生物安全監(jiān)督和管理工作建成體系；將此工作滲入到流感防控的各項工作中，并使其制度化、常態(tài)化和長效化。

4)建議充分發(fā)揮相關(guān)學會、專業(yè)委員會的民間團體作用，聯(lián)合政府、社會各機構(gòu)做好科普宣傳工作，警示和提高流感科研工作者生物安全層面的倫理道德、職業(yè)操守和自律意識，提高公眾對“兩用性”科研成果的敏感性和主動監(jiān)督意識。

4 總結(jié)與展望

實驗室重構(gòu)流感病毒是把“雙刃劍”，一方面對于揭示流感病毒跨種間傳播的分子機制、闡明不同毒株具有不同感染力和致病力的分子機理以及研發(fā)新型抗流感藥物具有重要意義；另一方面卻存在著重構(gòu)出強毒株、耐藥株以及病毒泄露引發(fā)新型流感大流行的生物風險。如何評價實驗室重構(gòu)流感病毒研究的科學價值和社會價值是值得廣大科研工作者深思的課題。生物安全相關(guān)政策、管理制度的健全和完善最終體現(xiàn)為科研工作者的操作規(guī)范，因此，從事流感研究的科研人員應(yīng)當明確科研目的和社會責任，將生物安全意識貫穿于整個流感病毒研究工作的始終，充分體現(xiàn)科學家的價值觀和使命感，盡可能規(guī)避風險，體現(xiàn)重構(gòu)流感病毒科學研究的社會意義。

[1]Berns KI,Casadevall A,Cohen ML,et al.Policy:adaptations of avian flu virus are a cause for concern.Nature,2012,482(7384):153–154.

[2]Berns KI,Casadevall A,Cohenn ML,et al.Public health and biosecurity.Adaptations of avian flu virus are a cause for concern.Science,2012,335(6069):660–661.

[3]Wise HM,Foeglein A,Sun J,et al.A complicated message:identification of a novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment 2 mRNA.J Virol,2009,83(16):8021–8031.

[4]Chen W,Calvo PA,Malide D,et al.A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death.Nat Med,2001,7(12):1306–1312.

[5]Jagger BW,Wise HM,Kash JC,et al.An overlapping protein-coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host response.Science,2012.337(6091):199–204.

[6]Wise HM,Hutchinson EC,Jagger BW,et al.Identification of a novel splice variant form of the influenza A virus M2 ion channel with an antigenically distinct ectodomain.PLoS Pathog,2012,8(11):e1002998.

[7]Thompson WW,Shay DK,Weintraub E,et al.Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States.JAMA,2003,289(2):179–186.

[8]Neumann G,Noda T,Kawaoka Y.Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.Nature,2009,459(7249):931–939.

[9]Graham-Rowe D.Epidemiology:racing against the flu.Nature,2011,480(7376):S2–3.

[10]Liu D,Shi W,Shi Y,et al.Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection:phylogenetic,structural,and coalescent analyses.Lancet,2013,381(9881):1926–1932.

[11]Cohen J.Avian influenza.The limits of avian flu studies in ferrets.Science,2012,335(6068):512–513.

[12]Imai M,Watanabe T,Hatta M,et al.Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets.Nature,2012,486(7403):420–428.

[13]Zhang Y,Zhang Q,Kong H,et al.H5N1 hybrid viruses bearing 2009/H1N1 virus genes transmit in guinea pig by respiratory droplet.Science,2013,340(6139):1459–1463.

[14]Fouchier RA,Garcia-Sastre A,Kawaoka Y,et al.Pause on avian flu transmission research.Science,2012,335(6067):400–401.

[15]Butler D.Fears grow over lab-bred flu.Nature,2011,480(7378):421–422.

[16]Imperiale MJ,Hanna MG.Biosafety considerations of mammalian-transmissible H5N1 influenza.MBio,2012,3(2):e00043–12.

[17]General biosafty standard for microbiolgy and biomedical laboratories.ws233-2002(in Chinese).微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則WS-233-2002.

[18]Laboratory—General requirements for biosafety.GB19489-2008(in Chinese).實驗室生物安全通用要求.GB19489-2008.

[19]Eornile D.Infectious diseases.Mounting lab accidents raise SARS fears.Science,2004,304(5671):659–661.

[20]Li WY,Li H,Kuang Y,et al.Construction of biological safety guarantee system of pathogenic micro-organism laboratory.Exper Sci Technol 2013,11(1):156–158(in Chinese).李婉宜,李華,鄺玉,等.病原生物實驗室生物安全保障體系的建設(shè)和思考.實驗科學與技術(shù),2013,11(1):156–158.

[21]Wei M,Kong LH,Li P,et al.Safety and hygienic protection in animal experiment teaching.J Prev Med Inf,2013,29(5):431–433(in Chinese).魏明,孔令恒,李萍,等.動物實驗教學的衛(wèi)生安全防護.預防醫(yī)學情報雜志,2013,29(5):431–433.

[22]Hao ZH,Zhao HD.An approach to biosafety containment of animal laboratory.Lab Ani Sci,2010,27(4):62–64(in Chinese).郝智慧,趙厚德.動物實驗的生物安全防護初探.實驗動物科學,2010,27(4):62–64.

[23]Li H,Zhang RY,Zhao RZ,et al.Investigation of the awareness in laboratory biosafety among teachers and students of medical colleges in Jiangsu province.Chin J Dis Control Prev,2010,14(5):447–450(in Chinese).厲洪,張汝陽,趙人爭,等.江蘇省醫(yī)學院校師生實驗室生物安全知識認知情況現(xiàn)狀調(diào)查.中華疾病控制雜志,2010,14(5):447–450.

[24]Enquist LW,Vande Woude GF,Wagner M,et al.Construction and characterization of a recombinant plasmid encoding the gene for the thymidine kinase of herpes simplex type 1 virus.Gene,1979,7(3/4):335–342.

[25]Sang WG,Ma KP,Wei W.Management mechanism of biotechnology safety in China and abroad.Biodiv Sci,2000,8(4):413–421(in Chinese).桑衛(wèi)國,馬克平,魏偉.國內(nèi)外生物技術(shù)安全管理機制.生物多樣性,2000,8(4):413–421.