張俊俠,馬 玉,肖 禾,焦小珂

(1.成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院,四川 成都 611137;2.四川中方制藥有限公司,四川 廣元 628000)

不同產(chǎn)地夏枯草藥材HPLC指紋圖譜研究

張俊俠1,馬 玉1,肖 禾2,焦小珂2

(1.成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院,四川 成都 611137;2.四川中方制藥有限公司,四川 廣元 628000)

目的:比較不同產(chǎn)地夏枯草藥材HPLC指紋圖譜,建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定和可重復(fù)的夏枯草藥材質(zhì)量評價(jià)方法,為其質(zhì)量控制提供參考.方法:采用高效液相色譜法,Shimadzu VP-ODS C18柱色譜柱;A相為1%醋酸,B相為甲醇組成的梯度洗脫液;檢測波長290 nm;柱溫30℃;流速1.0mL/min;分析時(shí)間60 min.結(jié)果:該方法可以使夏枯草中的各成分較好分離,并根據(jù)檢測結(jié)果確定了14個(gè)共有峰,進(jìn)行相似度評價(jià),10批藥材中有2批藥材與對照指紋圖譜的相似度較小,分別為0.133和0.062,其余8批均達(dá)到0.850以上,說明不同產(chǎn)地的夏枯草藥材指紋圖譜既有共性也具有一定的差異.結(jié)論:建立的不同產(chǎn)地夏枯草高效液相色譜職位圖譜方法精密度高、重復(fù)性好,方法穩(wěn)定可靠,可以有效地用于夏枯草原材料質(zhì)量控制和鑒定.

夏枯草;HPLC;指紋圖譜;質(zhì)量控制

0 引 言

夏枯草為唇形科植物夏枯草的干燥果穗,具有清火、明目、散結(jié)、消腫之功效[1].研究表明,夏枯草主要含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等成分[2].目前,夏枯草臨床上主要用于目赤腫痛、頭痛眩暈、甲狀腺腫大、淋巴結(jié)結(jié)核,高血壓等病癥的治療,是一味應(yīng)用廣泛、療效確切的傳統(tǒng)藥材[3].夏枯草的產(chǎn)地分布于全國各地,由于不同產(chǎn)地的夏枯草藥材物質(zhì)基礎(chǔ)存在一定差異,其療效也會有所差別,難以進(jìn)行質(zhì)量控制.而指紋圖譜由于其具有專屬性、唯一性、整體性等特點(diǎn),適合對中藥的整體質(zhì)量評價(jià),其中HPLC指紋圖譜應(yīng)用最為廣泛[4].本研究通過對不同產(chǎn)地的夏枯草進(jìn)行測定和分析,建立不同產(chǎn)地夏枯草藥材的HPLC指紋圖譜,擬為中藥材質(zhì)量控制提供一種有效的方法.

1 儀器與試藥

實(shí)驗(yàn)所用的儀器包括:島津LC2010A液相色譜儀,二極管陣列檢測器;Sartorius電子天平(Sartorius公司),KQ-100DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ShimadzuVP-ODS C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μ m).

實(shí)驗(yàn)所用試藥包括:甲醇為色譜純,乙醇、醋酸為分析純,水為超純水;夏枯草共10批,其來源如表1所示.

表1 夏枯草藥材產(chǎn)地與來源

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用圖譜相似性評價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)及SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件.

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜色譜條件及藥材提取方法的建立

2.1.1 供試品溶液制備.

夏枯草4 g,用60%乙醇回流提取 2 h,獲得60%醇提部位溶液;過濾,將濾液于98°水浴鍋上濃縮干燥,將干燥物用10 mL 60%乙醇溶解,超聲10 min,定容,制備成供試品溶液.

2.1.2 色譜條件.

WondaSil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m),流動相為,甲醇A、B為0.5%冰醋酸,梯度洗脫程序?yàn)?0～5 min、A 2%～ 15%,5～ 40 min、A 15%～50%,40～ 50min、A 50%～50%,50～60 min、A 50%～60%,60～ 65 min、A 60%～ 60%,65～ 70 min、A 60%～2%.分析時(shí)間70 min,流速1.0 mL/min,波長290 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μ L.夏枯草的HPLC特征指紋圖譜如圖1所示.

圖1 夏枯草HPLC特征指紋圖譜

2.2 方法學(xué)及其考察

2.2.1 精密度試驗(yàn).

取同一夏枯草樣品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的 RSD,結(jié)果見表2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,保留時(shí)間和峰面積的RSD都小于3.0%,表明儀器精密度良好.

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn).

取同一夏枯草樣品溶液,分別于 0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定,考察其穩(wěn)定性.計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD,結(jié)果見表2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,保留時(shí)間和峰面積的RSD都小于3.0%,表明藥物在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn).

精密稱定同一批樣品,按供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液,按上述色譜條件測定,計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD,結(jié)果見表2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,保留時(shí)間和峰面積的RSD都小于3.0%,表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好.

3 不同產(chǎn)地夏枯草指紋圖譜分析

3.1 共有峰的確定

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),10批不同產(chǎn)地夏枯草樣品的色譜指紋圖譜雖然有一定差異,但其中有14個(gè)色譜峰為夏枯草藥材的共有特征峰,計(jì)算共有特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積,結(jié)果見表3與圖2.

表2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察結(jié)果

圖2 10批夏枯草藥材色譜圖

3.2 不同產(chǎn)地夏枯草的指紋圖譜相似度評價(jià)

對10批夏枯草進(jìn)行指紋圖譜測定,用相關(guān)系數(shù)、夾角余弦及中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件計(jì)算相似度,結(jié)果見表4.

4 討 論

4.1 樣品制備方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了用甲醇及30%、60%、95%乙醇提取及水提醇沉等方法篩選樣品提取條件.結(jié)果表明,60%乙醇提取液色譜峰峰形好,基線穩(wěn).因此,本實(shí)驗(yàn)選用60%乙醇提取.

4.2 HPLC色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用PDA檢測器所獲得的各主要色譜峰紫外吸收光譜在254,290,320 nm波長附近有明顯吸收.其中,290 nm檢測條件下,色譜峰較多,各峰吸收均勻,基線平穩(wěn).因此,確定290 nm為檢測波長.

表3 10批藥材共有峰的相對保留時(shí)間

表4 10批藥材的相似度評價(jià)

4.3 夏枯草藥材指紋圖譜分析

夏枯草藥材相似度分析結(jié)果表明:10批藥材中有2批藥材與對照指紋圖譜的相似度較小,分別為0.133和0.062,對應(yīng)產(chǎn)地為安徽;其余8批均達(dá)到0.850以上,對應(yīng)產(chǎn)地分別為廣元、江蘇、河南、浙江,其相似度較好.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各產(chǎn)地夏枯草指紋圖譜既有共性也有一定的差異,這可能與藥材產(chǎn)地的土壤條件、氣候環(huán)境與種植方法等因素有關(guān),這有待進(jìn)一步考察.本研究所建立的方法穩(wěn)定可靠、精密度高、重現(xiàn)性好,可以有效地用于夏枯草藥材的質(zhì)量控制和鑒定.

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 王祝舉,趙玉英,涂光忠,等.夏枯草化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1999,34(9):679-681.

[3] 劉國強(qiáng),孫巖輝.夏枯草的臨床研究[J].黑龍江醫(yī)藥,2005,18(64):48-449.

[4] 房德敏.中藥指紋圖譜技術(shù)的研究與應(yīng)用[J].中草藥,2005,36(4):236-237.

Study on Selfheal Medicinal Materials HPLC Fingerprint in the Different Production Region

ZHANGJunxia1,MA Yu1,XIAO He2,JIAO Xiaoke2
(1.School of Medicine and Nursing,Chengdu University,Chengdu 610106,China;2.Sichuan Central Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guangyuan 628000,China)

This paper establishs accurate,stable and repeatable quality evaluation method of selfheal medicinal materials to provide a reference for quality control by comparing selfheal HPLC fingerprint from different origins.HPLC and Shimadzu VP-ODS C18 column chromatography were used.A mobile phase was 1%acetic acid.B mobile phase was gradient elution of methanol and detection wavelength was 280 nm;The column temperature was 30℃;Velocity was 1.0 mL/min;Analysis of time was 70 mins.Results showed that thismethod made each component in selfheal medicinal materials separate better.According to the detection results,fourteen common peaks were determined for similarity evaluation.Two batches of 10 batches medicinal material shad small reference fingerprint similarity,respectively 0.133 and 0.062.The remaining 8 batches were above 0.850.It indicated that selfheal fingerprints of different origins had both similarities and certain differences.We conclude that the discussed method has high precision,good repeatablity and reliablity and can be effectively used for the selfheal raw materials quality control and identification.

selfheal;HPLC;fingerprint;quality control

R284.1

A

1004-5422(2013)01-0020-04

2012-11-12.

四川省企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)——夏枯草膏質(zhì)量控制技術(shù)研究(2011XM062)資助項(xiàng)目.

張俊俠(1960—),女,副教授,從事中藥及天然藥物成分與質(zhì)量研究.