王 淋，烏云塔娜，葉生晶

（1.中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.林學院，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；3.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；4.國家林業(yè)局中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設計院，湖南 長沙 410014）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是落葉喬木，高達20 m，皮、枝及葉均含膠質(zhì)[1]。杜仲是我國特有的物種，也是名貴的藥材，富含大量綠原酸、類胡蘿卜素等活性成[2-3]，不僅如此，杜仲還是寶貴的天然橡膠資源[4]。杜仲膠獨有的橡塑二重性，廣泛應用于工業(yè)、建筑以及人們的日常生活中，作為我國特有的經(jīng)濟物種，栽培面積廣泛，不僅在北京、河南、河北，而且在新疆的喀什等地區(qū)都能生長[5]，我國杜仲的栽培面積占世界總栽培面積的90%以上，因此我國被譽為是世界上溫帶膠資源最為豐富的國家[6-7]。

杜仲膠的化學成分為聚異物二烯，與天然橡膠的順勢異戊二烯相比，杜仲膠為反式異戊二烯，分子式相同，但結(jié)構(gòu)始不同，均屬于多萜類化合物[8]。萜類化合物（isoprenoid）是植物生長發(fā)育中重要的次生代謝產(chǎn)物[9]。天然萜類化合物都來源于2個基本的植物萜類物質(zhì)合成途徑，一是位于質(zhì)體的丙酮酸/磷酸甘油醛（MEP）途徑，另一個是位于細胞質(zhì)的甲羥戊酸為前體的甲羥戊酸（MVA）途徑[10]，這2個途徑均能合成萜類物質(zhì)前體異戊烯基焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)物二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）[11]。3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A還原酶（HMGR）是位于MVA途徑中的第1個限速酶，對于萜類生物合成的重要的調(diào)控作用[12-13]。在HMGR的催化作用下，3-羥基,3-甲基戊二單酰輔酶A（HMG-CoA）可以生成甲羥戊酸（MVA），這一過程是不可逆轉(zhuǎn)過程[14]。在MVA途徑中，HMGR家族基因?qū)祁愇镔|(zhì)合成的“碳流”變化起到了決定性的作用[15]。Harker等對HMGR進行了相關研究，得出HMGR的表達量與植物體內(nèi)萜類物質(zhì)的含量成正相關，因此提高HMGR的表達量有利于提高植物中萜類物質(zhì)的含量[16-20]。近年來，對其它植物HMGR的基因報道較多，但就杜仲HMGR基因的研究較少，從全基因組和轉(zhuǎn)錄組的角度對整個杜仲HMGR基因家族的分析和研究鮮見報道。

杜仲各個組織器官中含優(yōu)質(zhì)天然橡膠-杜仲膠，是目前極具發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)質(zhì)天然膠資源。目前，杜蘭英等[21]通過環(huán)剝與環(huán)割技術(shù)，大幅度提高杜仲產(chǎn)果量以及產(chǎn)膠量，但是沒有闡述杜仲膠的分子合成機制。

杜仲膠屬于多萜類化合物，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（HMGRS）是萜類化合物合成重要途徑MVA途徑的關鍵酶之一。本研究在杜仲轉(zhuǎn)錄組和基因組測序的基礎上，對EuHMGRS基因家族的一級結(jié)構(gòu)特征、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化關系、內(nèi)含子/外顯子、啟動子相關元件進行了系統(tǒng)分析，旨在為其功能研究和生物合成杜仲膠研究提供分子基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

文中數(shù)據(jù)來源于杜仲轉(zhuǎn)錄組以及全基因組數(shù)據(jù)庫[22-23]。

1.2 生物信息學分析方法

文中根據(jù)相關生物信息學分析軟件及數(shù)據(jù)庫 phytozome（http://www.phytozome.net/search.php） 數(shù)據(jù)庫、ExPASyProtParam（http: //cn．expasy.org）、TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）、PSIPRED（http: //bioinf.cs.ucl.ac.uk /psipred）、Swiss model（http://swissmodel.expasy.org/）、MEME（http://meme.nbcr.net/meme/）、GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）、PLACE （http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）、PLANT CARE （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、MEGA5.1和ClustalX2對杜仲HMGSR蛋白的結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化樹、保守結(jié)構(gòu)域以及啟動子元件等進行了預測和詳盡的分析[24-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HMGRS基因家族序列分析

對HMGRS基因進行多序列比對分析（見圖1）。在HMGRS基因均存在HMGRS蛋白特有的保守的活性位點，其中包括2個HMG-CoA結(jié)合位 點 EMPVGYVQIP、TTEGCLVA和 2個 NADP（H）結(jié)合位點DAMGMNM、GTVGGGT[26]，因此可以確定為杜仲HMGRS基因家族，在杜仲中該家族成員至少包含3個基因，記為EuHMGR12、EuHMGR18、EuHMGR19[27]。杜仲 HMGRS 與其它植物的HMGRS蛋白相比在中間區(qū)域和C端保守性高，在N端的序列相似性較低，預示不同的HMGRS基因功能上具有高度的保守性，但是對于在亞細胞定位可能會具有多樣性[28]。

2.2 HMGRS基因家族聚類分析

杜仲HMGRS基因家族與其它植物HMGRS基因的聚類分析（見圖2）。不同植物的HMGR基因之間同源性很高，其在進化上具有很強的保守性。根據(jù)系統(tǒng)進化樹可知，19個HMGR基因的氨基酸序列分為3個分支：單子葉植物、雙子葉植物以及苔蘚類植物，這3個分支完全符合植物的分類規(guī)律。杜仲HMGRS基因家族與雙子葉植

物葡萄和擬南芥的HMGS基因家族同為一個大分支，EuHMGS12與EuHMGS18和EuHMGS19不屬于同一分支，EuHMGS12與VvHMGR3的遺傳距離較為接近，而EuHMGS18和EuHMGS19與VvHMGR2的遺傳距。

圖1 全長HMGRS蛋白多序列對比Fig.1 Multiple sequence alignment of the full length HMGRS proteins

圖2 HMGRS蛋白的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of HMGRS proteins

2.3 HMGRS基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

對HMGRS基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行了預測，結(jié)果見表1。HMGRS基因編碼氨基酸為404～642之間；相對分子質(zhì)量為44～69；理論等電點為5.9～10.0；其中EuHMGRS基因編碼氨基酸為580～590之間。由不穩(wěn)定系數(shù)可 知，EuHMGS19、PpHMGR1、PpHMGR2、PpHMGR3、VvHMGER2、ZmHMGR3為 穩(wěn) 定 蛋白， 而 AtHMGR1、AtHMGR2、EuHMGR12、EuHMGR18、OsHMG2、OsHMGR1、VvHMGR1、VvHMGR3、ZmHMGR1、ZmHMGR2、ZmHMGR4、ZmHMGR5、ZmHMGR6、ZmHMGR7為不穩(wěn)定蛋白。由蛋白質(zhì)的親水/疏水性可知，AtHMGR1、EuHMGR18、EuHMGR19、OsHMG2、OsHMGR1、 PpHMGR1、PpHMGR3、VvHMGR2、VvHMGR1、ZmHMGR3、ZmHMGR4為親水性蛋白，而AtHMGR2、EuHMGR12、PHMGR2、VvHMGR3、ZmHMGR1、ZmHMGR2、ZmHMGR5、ZmHMGR6、ZmHMGR7為疏水性蛋白。因此，同一家族的HMGRS基因理化性質(zhì)參數(shù)也有很大不同。

表1 EuHMGRS編碼蛋白質(zhì)的基本理化參數(shù)Table 1 Some basis physical and chemical parameters of EuHMGRS

2.4 HMGRS基因蛋白結(jié)構(gòu)保守域預測

利用MEME在線工具分析HMGRS氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)（見圖3、圖4）。除了ZmHMGR3以外，其它植物HMGR的氨基酸序列均含有3個HMG-CoA-reductaseclass功 能 域：RfSCsTGDaMGmNmV、VGtVGGGT、AIaAgqLvKSHMkY， 其 中RfSCsTGDaMGmNmV、VGtVGGGT包含了2個NADP（H）結(jié)合位點，其中EuHMGR12的3個功能域分別位于355～369 aa、 510～517 aa、564～577 aa；EuHMGR18的3個功能域分別位于 354～ 368 aa、509～ 516 aa、563～ 576 aa；EuHMGR19的3個功能域分別位于350～364 aa、505～512 aa、559～572 aa。

2.5 EuHMGRS基因家族的蛋白質(zhì)基因跨膜結(jié)構(gòu)域的預測

應用TMHMM-2.0對EuHMGS12、EuHMGS18和EuHMGS19跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析（見圖5）。結(jié)果表明杜仲HMGRS均具有2個跨膜區(qū)，EuHMGS12的跨膜區(qū)為：TMhelix1（46～68）、TMhelix2（89～111）；EuHMGS18的跨膜區(qū)為：TMhelix1（42～ 64）、TMhelix2（85～ 107）；EuHMGS19的跨膜區(qū)為：TMhelix1（41～63）、TMhelix2（84～106）。EuHMGS的2個跨膜區(qū)均含有22個氨基酸殘基；跨膜區(qū)氨基酸數(shù)位置極為相似，2個跨膜區(qū)均位于N端，C端無明顯的跨膜區(qū)。已知大多數(shù)植物HMGR蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中運轉(zhuǎn)，具有相同的拓撲跨膜結(jié)構(gòu)，HMGR蛋白行使功能不是完全在細胞質(zhì)中進行，而是通過短氨基酸鏈連接2個跨膜區(qū)，經(jīng)蛋白運轉(zhuǎn)，完成萜類物質(zhì)的生物合成[24-25]。

圖3 HMGRS基因的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domains in HMGRS gene

圖4 HMGR蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.4 The functional domains in HMGR protein

圖5 EuHMGRS蛋白的跨膜區(qū)預測Fig.5 Predicted transmembrane region of the deduced protein of EuHMGRS protein

2.6 EuHMGRS基因家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)的預測

通過GOR4在線預測EuHMGRS蛋白二級結(jié)構(gòu)（見圖6）。結(jié)果表明，EuHMGR12蛋白二級結(jié)構(gòu)為α-螺旋占42.88%，β-折疊占12.88%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占44.24%；EuHMGR18蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占42.88%，β-折疊占12.88%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占44.24%；EuHMGR19蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占43.45%，β-折疊占13.79%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占42.76%；EuHMGRS蛋白二級結(jié)構(gòu)較為相似，均屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

2.7 EuHMGRS基因家族蛋白的三級結(jié)構(gòu)的預測

通過在線SWISS-MODEL中的Automated Mode進行同源建模得到EuHMGRS蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型（見圖7）。ExPAsy structure assessment 程序評測推導的EuHMGR12蛋白模型QMEAN6 得分為0.63，蛋白序列的相似性為55.37 %；EuHMGR18蛋白模型QMEAN 6 得分為0.62，蛋白序列的相似性為57.92 %；EuHMGR19蛋白模型QMEAN 6 得分為0.61，蛋白序列的相似性為57.14 %。

圖6 EuHMGRS蛋白二級結(jié)構(gòu)預測Fig.6 Predicted secondary structure of the deduced EuHMGRS protein

圖7 EuHMGRS蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Fig.7 Predicted tertiary structure of the deduced EuHMGRS protein

2.8 EuHMGRS基因的內(nèi)含子和外顯子預測及分析

將杜仲HMGRS基因組序列及其對應的完整編碼序列（coding sequence CDS）提交到GSDS在線網(wǎng)站預測基因組的序列特征（見圖8，表2）。EuHMGS基因家族不同的基因具有不同的外顯子和內(nèi)含子數(shù)量。EuHMGR12有4個外顯子，3個內(nèi)含子，其中位于0、1、2相位的內(nèi)含子各占1個；EuHMGR18有4個外顯子，2個內(nèi)含子，其中位于0、2相位的內(nèi)含子各占1個，無1相位的內(nèi)含子；EuHMGR19有2個外顯子，1個內(nèi)含子，內(nèi)含子屬于1相位。

圖8 EuHMGRS基因內(nèi)含子和外顯子預測Fig.8 Prediction of the introns and exons in EuHMGRS

表2 EuHMGRS外顯子和內(nèi)含子分布序列Table 2 Distribution sequence of the introns and exons in EuHMGRS bp

2.9 EuHMGRS基因家族啟動子的順式元件作用分析

利用PLACE 和plantCARE 在線數(shù)據(jù)庫，預測EuHMGRS啟動子（5′UTR 2 000 bp）的主要順式元件潛在的分布以及功能，EuHMGRS家族基因啟動子主要順式元件潛在的分布以及功能見表3。EuACOTS家族啟動子含有大量基本順式作用元件TATAbox、CAATbox，參與生理調(diào)節(jié)（circadian）、防御與脅迫（TC-rich repeats）、熱脅迫（HSE）、脫落酸（ABRE）應答相關調(diào)控元件。其中EuHMGR12特有低溫（LTR）和厭氧（ARE）響應作用元件；EuHMGR12可能參與受低溫脅迫或厭氧基因的表達調(diào)控；EuHMGR18特有赤霉素（TATC-box）、水楊酸（TCA-element）以及真菌誘導（Box-W1）響應元件響應元件，EuHMGR18可能參與生長素相關基因的調(diào)控，此外EuHMGR18還具有6個增強子（TA-rich region）可大大的提高了基因的轉(zhuǎn)錄頻率；而EuHMGR19中的順式作用元件與分生組織（CAT-box）以及種子特異表達（RY-element）等相關。

表3 EuHMGRS基因啟動子區(qū)順式元件作用預測Table 3 Function prediction of the cis-elements of promoter in EuHMGRS

續(xù)表3Table 3 Continuation

3 結(jié)論與討論

隨著越來越多的植物全基因組測序的完成，從全基因組的角度來分析和研究基因家族成為可能。植物體內(nèi)的萜類代謝是植物體內(nèi)重要的代謝途徑，是植物中不可少的部分[29]。HMGR是植物甲羥戊酸代謝途徑的第1個關鍵酶，對甲羥戊酸代謝碳流的調(diào)控起決定作用[30]。根據(jù)葡萄、擬南芥、水稻、玉米等HMGR基因序列相似分析可知，杜仲HMGRS家族基因在N端較低，而中間和C端區(qū)域的保守型較高，且具有2個HMG-CoA結(jié)合位點（EMPVGYVQIP、TTEGCLVA）和2個NADP（H）結(jié)合位點（DAMGMNM、GTVGGGT），這些序列特征與其它植物的HMGR基因家族相一致。EuHMGRS基因家族3個基因的遺傳距離較近，但是屬于不同的進化分支。馬鈴薯HMGR基因家族中HMGR1基因的表達與甾類化合物合成相關，而HMGR2和HMGR3基因的表達與倍半萜植保素合成相關[31]。因此，推測EuHMGR12、EuHMGR18、EuHMGR19在參與萜類物質(zhì)合成時功能具有多樣性。

目前，HMGR被認為是該合成途徑中第1個最關鍵的限速酶[32]。Wititsuwannakul[33]等提出調(diào)節(jié)巴西橡膠HMGR基因的表達量會影響橡膠的生物合成量。因此推斷，提高杜仲HMGRS基因，勢必會對杜仲膠的生物合成產(chǎn)生一定影響。

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點主要在轉(zhuǎn)錄起始位點上游附近出現(xiàn)[34]，本研究選取轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp 啟動子序列進行啟動子元件預測分析。EuHMGR基因家族含有大量基本元件TATA 框（TACATAAA）和CAAT框（CAAT），同時還含有光（BoxⅠ等）、熱脅迫（HSE）、脫落酸（ABRE）等相關元件，EuHMGR家族基因不是含有大量相同的作用元件，且每個家族成員還存在特異的啟動元件，不同的基因啟動子順式作用元件使基因?qū)Σ煌h(huán)境的響應及基因表達的能力均有所不同。

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