滿朝來，甄鑫，唐高霞，趙麗，李鳳，弭曉菊

哈爾濱師范大學生命科學與技術學院 黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150025

雞microRNA的研究進展

滿朝來，甄鑫，唐高霞，趙麗，李鳳，弭曉菊

哈爾濱師范大學生命科學與技術學院 黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150025

滿朝來, 甄鑫, 唐高霞, 等. 雞microRNA的研究進展. 生物工程學報, 2013, 29(5): 578?585.

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microRNA (miRNA) 是參與基因轉錄后調控的一類重要的非編碼小 RNA分子。以下簡要總結雞miRNA的數(shù)量與染色體分布，同時概述了雞miRNA對免疫、胚胎發(fā)育和病毒感染的調控作用，最后對雞miRNA的應用前景也進行了簡單探討，以期為miRNA在禽業(yè)生產中的深入研究和應用提供參考。

雞，microRNA，免疫，胚胎發(fā)育，病毒

microRNA (miRNA) 是一類高度保守的、功能性的、非編碼單鏈小RNA (長約19～24 nt)，其采用序列特異性方式結合到 mRNA 3￠非翻譯區(qū)(UTR) 的互補序列上，參與轉錄后基因表達調控，調控著從細胞分化到機體發(fā)育多種生物過程。雞作為一種中間進化模式生物，在脊椎動物生命科學研究中具有諸多優(yōu)勢，例如雞為卵生，胚胎便于體外操作與觀察，方便獲得基因組DNA等，雞已經(jīng)成為生命科學研究中的優(yōu)秀動物模型之一。以雞為模式生物研究miRNA生物學問題，對于深入理解和發(fā)現(xiàn)miRNA功能和作用機制，開發(fā)和指導miRNA在禽業(yè)生產中的應用具有重要的參考和經(jīng)濟價值。

1 雞miRNA的數(shù)量與染色體分布

目前，雞 miRBase數(shù)據(jù)庫 (http://www.mirbase.org/) 中已公布684條miRNA前體和791條miRNA成熟體。從染色體分布來看，miRNA前體分別來源于不同染色體，具體染色體分布概況為：染色體1為80條、染色體2為69條、染色體3為53條、染色體4為56條、染色體5為35條、染色體6為16條、染色體7為23條、染色體8為27條、染色體9為23條、染色體10為28條、染色體11為15條、染色體12為15條、染色體13為13條、染色體14為20條、染色體15為18條、染色體17為14條、染色體18為12條、染色體19為21條、染色體20為20條、染色體21為8條、染色體22為2條、染色體23為10條、染色體24為13條、染色體24為13條、染色體25為6條、染色體26為12條、染色體27為9條、染色體28為12條、染色體Z為31條，還有23條miRNA前體未確定染色體來源。從染色體分布規(guī)律來看，雞的6對大染色體 (染色體 1、2、3、4、5和 Z) 分布的 miRNA前體的數(shù)目都在30條以上，其中以染色體1為最多(80條)，這可能與這些染色體的長度大、基因多和功能復雜有關，而染色體16、32和W尚未發(fā)現(xiàn)miRNA前體序列。

與人的miRNA前體 (1 600條) 和miRNA成熟體 (2 042條) 數(shù)目相比較而言，雞miRNA的發(fā)現(xiàn)和挖掘可能還存在一定空間，因為Glazov等[1]利用深度測序法 (Deep sequencing approach)對雞胚的不同發(fā)育階段 (5 d、7 d和9 d) 測得了3個小RNA庫，產生950萬條短序列，他們對這些小RNA進行分類后發(fā)現(xiàn)，幾乎檢測到了所有先前已知的雞 miRNA和它們各自的miRNA*序列 (表達水平較低的 miRNA后面常加上*號，但現(xiàn)在名稱標記有所變化)。此外，他們發(fā)現(xiàn)了449條新的雞miRNA (包括88條候選的miRNA)，其中430條miRNA是鳥類所特有的，另外6條新miRNA具有與鳥類以外至少一個種屬脊椎動物的存在進化序列保守的特性，剩余的13條假定miRNA (Putative miRNA) 是已知脊椎動物miRNA在雞中的同源序列。另外還發(fā)現(xiàn) 39條額外的剪接來源的 miRNA(Splicing-derived miRNA，mirtron)。相信隨著研究的不斷深入，雞miRNA家族的新成員還會被逐漸發(fā)現(xiàn)和公布。

2 雞miRNA對免疫功能的調控

miRNA是基因表達的一類重要轉錄后調控子，但是關于每個miRNA調控靶基因表達的獨特功能卻知之甚少。目前，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在免疫調控中起重要作用，miRNA可能與經(jīng)典的天然免疫應答體系共同組成機體抵御病原微生物入侵的“第一道防線”，而且miRNA水平的相互作用可能是病原微生物與其宿主展開免疫“博弈”的重要戰(zhàn)場，這些相互作用的結果導致許多基因和基因產物的激活，多條路徑匯聚在一起進而富集了特定miRNA。例如，轉錄因子AP-1和NF-kB的激活會導致miR-155的數(shù)量增加[2]，而miR-155是正常獲得性免疫反應所必需的，能夠調節(jié)輔助性 T細胞分化和生發(fā)中心反應以產生最適 T細胞依賴性抗體反應 (T cell dependent antibody response，TDAR)。miR-155還能夠通過調節(jié)細胞因子生成量的變化來實現(xiàn)對 T細胞功能的調節(jié)，而且B細胞發(fā)生同型轉換和產生高親和力抗體及記憶細胞反應時也需要 miR-155的參與[3]。

動物的免疫反應必須被精細調節(jié)才能達到免疫應答和免疫耐受的恰當平衡，相對于蛋白因子的調節(jié)方式，miRNA似乎更適合對免疫系統(tǒng)進行精細和定量調節(jié)。miRNA不但在天然免疫反應的不同時期起重要的調控作用，而且在T細胞和B細胞發(fā)育及T細胞功能和抗體產生等獲得性免疫過程中，miRNA呈現(xiàn)出特有的時空動態(tài)表達方式，暗示miRNA在獲得性免疫中也具有重要的調控作用；此外，與其他基因相比較而言，miRNA的靶向位點對免疫基因具有更高的選擇傾向，這不僅進一步說明miRNA是免疫系統(tǒng)的關鍵調控子，而且miRNA在免疫系統(tǒng)中具有多樣性功能[4]。

在雞中，雖然關于免疫相關miRNA的功能研究報道較少，但現(xiàn)有研究成果已經(jīng)初步證明了雞miRNA在免疫系統(tǒng)調控中的重要性。例如，為發(fā)現(xiàn)參與免疫反應的非編碼免疫相關基因，Ahanda等[5]利用雞的免疫活性組織制備了一批cDNA序列，他們不但發(fā)現(xiàn)了已知非編碼 RNA(miRNA，snRNA，snoRNA)，還鑒定了一些新的假定miRNA樣非編碼RNA (Putative mRNA-like non-coding RNA)。通過對這些樣品的表達譜進行鑒定后，發(fā)現(xiàn)一些非編碼RNA在病毒感染后表達發(fā)生了改變，而且這些非編碼RNA的表達方式與這些組織內的編碼蛋白 mRNA表達特征相一致，暗示這些非編碼RNA在免疫反應中可能具有活性作用。Trakooljul等[6]利用DNA微陣列分析和雙重熒光素酶報告檢測系統(tǒng)研究雞miR-143的下游靶基因，發(fā)現(xiàn)在體外利用anti-miR-143處理雞胚胎淋巴細胞后，有124個基因表達改變，而這些基因中許多都與細胞增生、凋亡和腫瘤形成有關，所以miR-143很可能參與調控淋巴細胞的增生和凋亡。此后，該課題組又對miR-10a的表達分布進行了研究，結果表明miR-10a在雞胚胎的脾臟發(fā)育中高表達，出生后在脾、肺、腎和脂肪組織等臟器中仍高表達，功能分析表明miR-10a能夠參與Ras信號相關通路、細胞內運輸和免疫功能發(fā)育等相關基因的表達調控[7]。還有，分泌性磷蛋白 1 (Secreted phosphoprotein 1，SPP1) 在炎癥反應、鈣化、器官發(fā)育、免疫細胞功能和致癌作用等生理過程中具有重要的作用，而在雞中miR-140能夠通過轉錄后調控來影響 SPP1的表達活性[8]，進而間接實現(xiàn)對免疫細胞功能的影響。Akirin2蛋白作為重要的核內轉錄因子在免疫反應中具有重要的調控作用，作者在研究雞akirin2基因的生物學功能時，預測分析發(fā)現(xiàn)akirin2基因的3￠UTR區(qū)域存在潛在一個 miRNA靶位點，而且 2個雞miRNA (gga-miR-1570和gga-miR-216b) 靶向這一相同的靶序列，說明akirin2基因的表達活性可能受這些 miRNA的調控[9]，而在哺乳動物中Akirin2是一個影響轉錄因子NF-kB轉錄活性的關鍵核內因子，參與 NF-kB依賴的免疫相關miRNA (如 miR-155、miR-181a、miR-17～92、miRNA-146和miR-223等) 的表達調控[10-12]，但是關于雞的akirin2基因與miRNA的調控相關性仍有待于深入研究?？傊絹碓蕉嗟淖C據(jù)表明雞miRNA也能夠以直接或間接的方式影響著免疫相關基因或細胞的活性，發(fā)揮著對免疫功能的調節(jié)作用。

3 雞miRNA對胚胎發(fā)育的調控

miRNA的組織特異性表達研究揭示了miRNA在胚胎發(fā)育中的多種功能，其中miRNA的一個主要作用就是調控發(fā)育過程中的靶基因表達。例如，Hicks等[13]利用11 d雞胚構建了一個小RNA文庫，獲得了10 466個序列，其中包括已知的雞miRNA、與其他物種同源的miRNA和新發(fā)現(xiàn)的 miRNA。他們發(fā)現(xiàn)許多已知的miRNA在雞胚的脾、肝和法氏囊中差異表達，表明孵化11 d雞胚中的miRNA表達是極其多樣和動態(tài)變化的，而且這種變化可能是與胚胎特征發(fā)育相對應的。

3.1 雞miRNA對骨骼發(fā)育的調控

高等脊椎動物利用相似的遺傳工具卻傳遞著極其不同的面部特征，這種多樣性被認為是通過顱神經(jīng)嵴細胞 (Cranial neural crest cells) 內基因的表達時間、空間和種屬特異性變化而實現(xiàn)的，這不僅會促進面部骨骼的形成，而且還包含著種屬特異性信息，從而導致形態(tài)的不同。在這一過程中，一些信號分子和轉錄因子起著重要作用，而關于miRNA在這一過程中的作用卻知之甚少。Powder等[14]通過對比鑒定和分析 3種禽類動物 (雞、鴨和鵪鶉) 特異性面部特征發(fā)生變化前后的顱神經(jīng)嵴細胞中全部miRNA的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)了 170個差異表達的 miRNA，并且在這個過程中這些miRNA的表達呈現(xiàn)顯著動態(tài)變化，這表明miRNA在胚胎頭面發(fā)育過程中起著重要作用。

在脊椎動物胚胎發(fā)育中，中軸骨 (Axial bone) 的形成需要精確時空調控Hox基因的表達。Hornstein等[15]研究表明：在雞體內肢體發(fā)育環(huán)境下，miR-196作用于Hoxb8和SHH (Sonic hedgehog) 上游，并且miR-196能夠確保被調控的表達域 (Expression domains) 在轉錄水平上的精準性，這表明miRNA功能上是作為一個二級水平的基因調控。隨后，McGlinn等[16]在雞胚胎發(fā)育中利用反義寡核苷酸技術，通過應用miR-196家族確定了雞胚軸形成前后Hox基因表達的時空界限，他們發(fā)現(xiàn)當miR-196表達被封閉后，雞胚的末尾頸椎 (Last cervical vertebrae) 存在向著胸椎特征方向同源異形轉化現(xiàn)象，而這種表型的改變部分原因是與轉化之前Hoxb8基因表達被上調有關，同時這也進一步佐證了Hox基因能夠被miRNA轉錄后調控的相關性。此外，miRNA在軟骨形成中還發(fā)揮著重要作用，例如，細胞凝聚 (Cellular condensation) 對成軟骨細胞的分化是一個必要的起始過程，Song等[17]通過研究miR-488在細胞凝聚中的作用，發(fā)現(xiàn)在雞胚肢間充質細胞 (Limb mesenchymal cells) 軟骨形成的過程中，miR-488是細胞與細胞外基質相互作用中的調控因子之一。

3.2 雞miRNA對神經(jīng)發(fā)育的調控

神經(jīng)發(fā)育是高度協(xié)調的生理過程，神經(jīng)元基因的表達是被嚴格調控的。在雞中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織發(fā)育中，SCP1(Small C-terminal domain phosphatase 1) 基因表達適時的下調對誘導神經(jīng)組織的發(fā)生至關重要，而在這一過程中miR-124參與了SCP1基因的表達下調過程[18]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-124的兩個內源性的靶標分別是層粘連蛋白 γ1 (Laminin gamma 1) 和整合素 β1(Integrin beta1) 兩個基因，這兩個基因在神經(jīng)祖細胞 (Neural progenitor cells) 中高表達，但在神經(jīng)細胞分化中被抑制，miR-124是通過對神經(jīng)祖細胞中祖基因 (Progenitor genes) 的轉錄后抑制進而實現(xiàn)神經(jīng)細胞的分化[19]。另外，在雞胚胎發(fā)育中，運動神經(jīng)元亞型的特化 (Specification of motor neuron (MN) subtypes) 和脊髓柱狀體形成(Columnar formation) 也受多種轉錄因子的調控。例如，F(xiàn)oxP1 (Forkhead box protein P1) 能夠驅動晚期運動神經(jīng)元亞型的特化，但是FoxP1的表達水平是受miR-9調控的，所以miR-9是運動神經(jīng)元特化和柱狀體形成的一個必要的調控子[20-21]。此外，miRNA對神經(jīng)細胞的正常發(fā)育和凋亡也起著重要的調控作用。例如Wang等[22]利用miRNA的微陣列分析表明miR-206是亞砷酸鈉 (SA) 誘導的雞胚神經(jīng)管缺陷 (Neural tube defects，NTDs) 的差異表達的特征性基因。在SA處理后的雞胚中 miR-206表達存在差異，miR-206過表達會促進U343和SK-N-SH細胞的凋亡，而miR-206低表達會抑制細胞凋亡，表明miR-206在調控神經(jīng)細胞凋亡的過程中可能起了重要作用。

3.3 雞miRNA對性腺發(fā)育的調控

在雞胚胎發(fā)育中，miRNA的組織特異性表達可以促進多種器官組織的發(fā)生，例如，miRNA在雞胚胎性腺組織發(fā)育中起著重要的調控作用。首先，miRNA能夠調控雞胚盤和原始生殖細胞(PGCs) 的分化，而且生殖細胞的特化時間也是通過miRNA的表達來調控的。Lee等[23]在雞胚胎和原始生殖細胞 (PGCs) 中已經(jīng)分別鑒定出7個和10個高表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA介導的轉錄后調控是維持胚盤和PGCs的未分化狀態(tài)所必需的。其中miR-302a和miR-456直接結合到性決定區(qū) Y盒 11轉錄體 (Sex-determining region Y box 11 transcript) 上，并且作為轉錄后共調控子來維持雞胚盤的未分化狀態(tài)。miR-181a*在 PGCs中通過結合 2個不同的轉錄體進而表現(xiàn)出雙重功能，miR-181a*通過沉默同源盒 A1的表達來抑制 PGCs的體細胞分化(Somatic differentiation)，此外miR-181a*還可以通過抑制核受體亞家族6、A組1號轉錄體 (The nuclear receptor subfamily 6，group A，member 1 transcript) 來阻止PGCs進入減數(shù)分裂。

其次，雞胚胎通過雌性或雄性特異性基因表達來控制著性腺向著卵巢或睪丸方向發(fā)育，而在這一性腺分化過程中許多miRNA參與了調控。Bannister等[24]通過對雞早期胚胎體內注射雌二醇-17β來研究雌雄性腺的改變與 miR-202*表達的變化關系，結果表明 miR-202*的表達上調與雞胚睪丸分化步調相一致。Huang等[25]利用半定量 RT-PCR和全胚原位雜交方法 (Whole-mount in situ hybridization) 分析了雞胚胎早起發(fā)育階段 miR-363和 miR-363*前體的時空表達特征，發(fā)現(xiàn)miR-363的表達在雌雄雞胚 (E3.5 to 6.5 d)性腺中存在顯著差異，推測miR-363可能參與了性腺分化發(fā)育。Bannister等[26]又利用微陣列、原位雜交和 Northern blotting等方法研究發(fā)現(xiàn)miR-202*在雄性雞胚性別分化起始后睪丸發(fā)育中表達上調，這表明脊椎動物性腺分化過程中miRNA的表達是動態(tài)變化的，而且 miR202*可能在功能上參與了睪丸發(fā)育的調控。

最后，在雞性腺發(fā)育中大量表達的miRNA，其中一些在性腺分化過程中會表現(xiàn)出性別二態(tài)性表達方式 (Sexually dimorphic expression patterns)。例如，Cutting等[27]就發(fā)現(xiàn)miR-101、miR-31和miR-202-5p的這種表達方式對性腺分化中具有一定作用。

4 雞miRNA在病毒感染和致病中的作用

miRNA能夠被植物、動物和病毒所表達，它們的重要性在許多生理過程中通過不同的表達方式而得以凸顯出來。Burnside等[28]鑒定了禽類致瘤性馬立克氏病病毒 (MDV1)、非致瘤性馬立克氏病病毒 (MDV2)、火雞皰疹病毒 (HVT)和傳染性喉氣管炎病毒 (ILTV) 編碼的miRNA。發(fā)現(xiàn)每一種禽類皰疹病毒都含有獨特序列的miRNA，但它們的基因組定位 (Genomic location) 卻相似，這是因為miRNA傾向于成群聚集在病毒基因組的快速進化重復區(qū)域中。但不同地域來源的MDV1病毒株，miRNA卻高度保守，這些miRNA在裂解性感染、潛伏性感染和MDV1所致的腫瘤中均被表達，表明這些小分子對病毒來說非常重要，它們可能在病毒免疫逃避、抗凋亡和增生中發(fā)揮作用。雞 MDV1編碼的miR-4與miR-155具有相同的靶標，而且miR-4是miR-155的一個功能上的同源物，而miR-155在惡性淋巴瘤和免疫反應中具有重要調控作用，這表明了MDV1的miRNA在淋巴瘤形成的調控和生物學功能中的重要性[29-30]。

miRNA不但在多種生物學過程中起關鍵調控作用，而且還是復雜的宿主-抗原相互作用網(wǎng)絡中的重要效應因子。Wang等[31]從被低致病性的H5N3禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV)感染 4 d無特定病原體 (SPF) 雞的肺和氣管中提取總RNA，分別得到278 398條和340 726條序列，在肺中檢測到 377個 miRNA，在氣管中檢測到149個miRNA。其中，肺中73個和氣管中36個miRNA在感染組和未感染對照組間存在表達差異，而且在未感染組織中有更多的miRNA被表達。有意義的是，已研究表明一些差異表達的miRNA (包括miR-146) 是與哺乳動物免疫信號通路相關的。這表明某些miRNA在宿主-抗原相互作用中是必需的，所以闡明miRNA對宿主-AIV相互作用的調控機制，這對于開發(fā)新策略來預防和治療禽業(yè)生產中的 AIV感染問題具有重要的意義。

5 雞miRNA的應用展望

雞作為生命科學研究中的重要模式動物之一，在免疫學、發(fā)育生物學、微生物學和腫瘤等領域做出了杰出貢獻。同時，養(yǎng)雞業(yè)生產作為畜牧業(yè)發(fā)展中的重要部分，是人類最主要的肉蛋來源之一。當前，隨著家禽飼養(yǎng)規(guī)模的不斷擴大，國內外交往和貿易活動的日益頻繁，疾病傳播的機會大大增加，加之雞的免疫抑制性疾病及其他一些因素所造成的疫苗免疫抗體水平下降、免疫耐受和免疫失敗等問題，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，所以深入研究禽類免疫調控機制，對于改善和解決禽業(yè)生產的實際問題具有重要意義。目前，miRNA在免疫中的功能作用和應用價值逐漸被發(fā)現(xiàn)和重視，miRNA研究已經(jīng)成為生命科學研究中的熱點之一[11-12]，所以深入研究雞miRNA的功能及作用機制，對于理解復雜生物學過程和調控機制，以及開發(fā)和利用特定miRNA在禽類疾病診斷和防治中的可能應用具有重要的意義[32-33]。

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November 9, 2012; Accepted: February 25, 2013

Chaolai Man. Tel/Fax: +86-451-88060576; E-mail: manchaolai@126.com

黑龍江省自然科學基金項目 (No. C201135)，黑龍江省教育廳科學技術研究項目 (No. 12511140)，哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項基金 (No. 2012RFQXN005)，黑龍江省高校科技創(chuàng)新團隊研究計劃，哈爾濱師范大學科技創(chuàng)新團隊研究計劃 (No. KJTD-2011-2)資助。

Progress in chicken microRNAs

Chaolai Man, Xin Zhen, Gaoxia Tang, Li Zhao, Feng Li, and Xiaoju Mi

Key Laboratory of Molecular Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province,College of Life Science and Technology,Harbin Normal University,Harbin150025,Heilongjiang,China

microRNAs (miRNAs) are a family of important small non-coding RNA molecules, which participate in the post transcriptional gene regulation. In this review, the numbers and chromosomal distribution of chicken miRNAs, and the regulation and function of chicken miRNAs in immune, embryo development and virus infection were reviewed.Additionally, the applications of chicken miRNAs were also discussed briefly. We hope it can provide references for further study and use of miRNAs in poultry husbandry fields.

chicken, microRNAs, immunity, embryo development, virus

Supported by: Natural Science Foundation of the Heilongjiang Province (No. C201135), Science and Technology Foundation of the Education Department of Heilongjiang Province (No. 12511140), Harbin Technological Innovation Special Fund Research Project (No. 2012RFQXN005),Aid program for Science and Technology Innovative Research Team in Higher Educational Institutions of Heilongjiang Province and Harbin Normal University (No. KJTD2011-2).

(本文責編 陳宏宇)