龐 博 劉貴建

(中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院檢驗科，北京100053)

血液細胞分析是對包括血液病在內(nèi)的多種疾病進行診斷與鑒別診斷的重要手段。傳統(tǒng)的血液細胞分析主要依靠顯微鏡檢查，隨著分子生物學、免疫學等生命科學的發(fā)展，越來越多的疾病標志物與免疫表型標志物不斷涌現(xiàn)，使得通過分子標志物對細胞進行識別、分類成為可能。而現(xiàn)代自動化儀器的技術(shù)和檢測方法也在快速進步，這促使血細胞的自動化分析在臨床上有了較為普遍的應用。

近年來，全自動血細胞分析儀已經(jīng)在臨床實驗室普遍使用，流式細胞儀在一些大型教學醫(yī)院、綜合性醫(yī)院也開始較多的使用，血液數(shù)字化圖像分析設(shè)備也開始進入臨床實驗室。新的血液細胞檢驗技術(shù)仍在不斷涌現(xiàn)，自動化、流水線化、數(shù)字化與圖像化成為其主要發(fā)展趨勢。本文現(xiàn)對血液細胞分析技術(shù)的臨床應用和進展進行簡要綜述。

1 全自動血細胞分析儀的應用與進展

20世紀中葉，庫爾特以電阻率變化為基礎(chǔ)研制了性能較穩(wěn)定的血細胞計數(shù)儀，這為臨床血細胞分析步入自動化時代揭開了序幕。時至今日，全自動血細胞分析儀已在臨床上有了較為普遍的應用，其檢測技術(shù)更為先進，檢驗項目更為豐富，呈現(xiàn)出功能多樣化、流水線化的特點。

1)多種檢測技術(shù)聯(lián)合應用:在血細胞自動分析儀的應用早期，主要依靠單一的電阻法技術(shù)，可將細胞進行基本識別與分群，如白細胞可通過體積分布直方圖分為淋巴細胞群、粒細胞群和中間細胞群3個部分。中間細胞群包括了嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞和單核細胞等，尚不能通過單一阻抗技術(shù)進行區(qū)分，因而僅能實現(xiàn)白細胞的二分類或三分類。20世紀90年代后，一些五分類儀器得到臨床應用，這些儀器有不同的技術(shù)組合形式，如采用電阻法聯(lián)合高頻電導和激光散射，電阻法聯(lián)合熒光染色和激光散射，細胞化學染色聯(lián)合激光散射，多角度偏振光散射法等技術(shù)方法。不同技術(shù)的特點各不相同，如高頻電導是針對細胞核質(zhì)比例等內(nèi)部特征進行分析，激光散射則可分析細胞內(nèi)性質(zhì)不同的顆粒，熒光染色可以反映細胞內(nèi)核酸物質(zhì)的多少。不同種類白細胞內(nèi)含過氧化物酶的量不同，對其進行細胞化學染色可以實現(xiàn)將其區(qū)分的目的。這些技術(shù)的組合應用，可探測細胞的多種特征，從而實現(xiàn)了較為細致的分類。

2)優(yōu)化技術(shù)彌補不足:自動化儀器大大節(jié)約了人工涂片計數(shù)分類所耗費的時間與精力，但也存在一些不足。由于紅細胞(red blood cell，RBC)與血小板(platelet，PLT)的測量信號存在交叉，大的PLT會被誤認為是RBC，而小的RBC則會進行PLT通道參與計數(shù)，造成計數(shù)誤差。研究者們已將技術(shù)不斷優(yōu)化，以彌補這種不足。如二維光折射法可通過細胞體積和折射系數(shù)二維參數(shù)計數(shù)PLT，可以區(qū)分出PLT、小RBC、RBC碎片、RBC殘骸及電子噪音，在一定程度上提高了PLT計數(shù)的準確性。有的儀器加用了標記熒光的單抗簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)61以促進對血小板的識別。此外，還有掃流技術(shù)、防反流裝置、鞘流技術(shù)、浮動界標技術(shù)以及延時計數(shù)、擬合曲線等技術(shù)，也可以提高細胞計數(shù)的準確性。

3)檢測參數(shù)不斷豐富:目前，全自動血細胞分析儀也在不斷增加新的檢測功能，例如有的儀器增加了對網(wǎng)織紅細胞的識別功能，有的則增加了對幼稚細胞和有核紅細胞的分析，還有的儀器增加了流式細胞儀的功能，可以進行CD4、CD8、CD3的測定，因而實現(xiàn)了對淋巴細胞亞群的分型［1］。盡管這類全自動血細胞分析儀尚未在臨床上普遍應用，但反映出了其功能擴展化的趨勢，同時也應注意到臨床上對于血細胞分類進一步細化的需求越來越高［2］。

4)血液細胞分析的流水線化:近年來，血細胞分析儀逐漸發(fā)展成為全自動流水線，不僅包括血液常規(guī)自動化分析，而且通過自動制片機實現(xiàn)了血片的制備，樣本篩選、涂片、編號、染色、干燥等一系列步驟均由機器自動完成。根據(jù)常規(guī)檢測數(shù)據(jù)和直方圖的結(jié)果，儀器首先按照規(guī)則決定是否需要進一步鏡檢，根據(jù)紅細胞情況決定是否需要網(wǎng)織紅細胞計數(shù)，根據(jù)紅細胞壓積來決定涂片的角度和厚度，從而將人工篩選、涂片的過程自動化，使整個流程和操作趨向標準化［3］。

5)全自動血細胞分析儀存在的缺陷:盡管全自動血細胞分析儀在技術(shù)上已經(jīng)有了很大進步，但仍有一些缺點尚未解決。如對于有核紅細胞、中性粒細胞的中毒顆粒、異型淋巴細胞、血小板聚集的衛(wèi)星現(xiàn)象可能存在一定的識別困難。有的儀器雖具備異常細胞識別與報警能力，但往往其敏感性過高，很難達到理想的預期效果。同時單靠儀器也難以實現(xiàn)對球形紅細胞、點彩紅細胞、淚滴樣紅細胞、呈緡錢樣排列紅細胞等特殊形狀紅細胞的類型辨別。因此，為了獲得最為準確的信息，應充分認識到自動化技術(shù)的局限性，制定合理的復檢規(guī)則，將血細胞自動分析儀與人工鏡檢結(jié)合起來。

2 流式細胞術(shù)的應用與進展

流式細胞術(shù)最早源于20世紀60年代后期的斯坦福大學，并在隨后對獲得性免疫缺陷綜合征患者的診療中得到認可。發(fā)展至今，流式細胞術(shù)的用途得到了廣泛的擴展，已成為臨床實驗室較為常用的技術(shù)之一［4－5］。簡單地說，流式細胞術(shù)的原理就是把經(jīng)熒光染料標記過的細胞樣品制成單細胞懸液，在鞘液的幫助下逐個排列，經(jīng)激光檢測區(qū)受其激發(fā)，產(chǎn)生散射光和熒光信號，經(jīng)光電倍增管和探測器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖，進入計算機，以各種參數(shù)的方式顯示出來，再利用軟件進行分析。

1)流式細胞術(shù)在血細胞計數(shù)分類上的臨床應用:流式原理對血細胞進行技術(shù)與分型具有許多優(yōu)勢，其分析速度快，檢測指標多，且可以將項目靈活組合，在多個臨床領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。在免疫學方面，可通過對不同CD分子的檢測來鑒定不同的免疫細胞類型，明確其所占比例，也可同時通過對細胞因子的檢測來了解不同免疫細胞的功能狀態(tài)，從而推測出患者所處的不同免疫狀態(tài)［6］。因此，流式細胞術(shù)對于多種免疫相關(guān)疾病均有著重要的應用價值。在血液病方面，通過對其獨特抗原的分析，可對急性白血病、淋巴瘤進行診斷，這對于那些通過形態(tài)學檢查難以得出結(jié)論的患者來說尤為重要［7］。也可通過該技術(shù)檢測微小殘留病變，以了解白血病患者病情，及時采取措施避免復發(fā)［8］。此外，該技術(shù)還可對血小板功能進行檢測，對胞內(nèi)蛋白進行分析，計數(shù)網(wǎng)織紅細胞，通過監(jiān)測外周血或干細胞采集物中干細胞的含量來了解造血干細胞移植患者免疫重建的狀況。

2)流式細胞術(shù)的多色應用與可視化發(fā)展趨勢:近年來，9色或10色等多色流式細胞術(shù)的應用逐漸增加，其主要是針對白血病和淋巴瘤患者進行診斷和病情監(jiān)測［9－10］。多色流式細胞術(shù)的優(yōu)勢在于可以實現(xiàn)對細胞群進行更為精確的鑒定，僅使用少量樣本便可獲取該細胞群的詳細信息，大大提高實驗室工作效率，對少量異常細胞群實現(xiàn)持續(xù)監(jiān)測［10］。

普通的流式細胞術(shù)僅能對模擬信號進行分析，無法直接觀察到細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，無法實現(xiàn)細胞內(nèi)的熒光信號定位。研究者為了克服這些缺點，研發(fā)了可視流式細胞分析儀，也稱為顯微成像流式細胞儀。它能夠為每個細胞生成12張圖片，以反映其真實影像。在圖片中能夠區(qū)分熒光在細胞質(zhì)、細胞膜和細胞核的定位。點擊散點圖中的每個點或直方圖中的信號點，便可觀察到相應的細胞圖片。此外，使用者可以在FlowSight中觀察所設(shè)門內(nèi)外的細胞圖片，以此確認設(shè)門是否準確。這種可視功能無疑將大大拓展流式細胞術(shù)的分析能力，在一定程度上避免了設(shè)門不當導致的計數(shù)分類錯誤。

3 血細胞自動數(shù)字圖像分析

為了最大限度地將血細胞分析工作自動化、標準化和直觀化，人們又開發(fā)了可將細胞形態(tài)直接顯示在屏幕上的自動血細胞數(shù)字圖像分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于自動模式進行識別的神經(jīng)網(wǎng)絡分析方法運行的，它可以實現(xiàn)自動涂片、染色，并將100～200個白細胞進行預分類計數(shù)，將這些白細胞全部顯示于顯示屏上，十分簡便、快捷，且有利于標準化的實現(xiàn)。尤其對于異常形狀的白細胞、原始細胞和幼稚細胞的分類十分有益，也便于觀察紅細胞、血小板的形態(tài)，檢查寄生蟲感染情況等。Cornet等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，對于多種血液學參數(shù)，DM96與人工鏡檢的一致性可達98%?？捎糜诩甭园籽〉妮o助診斷。Ceelie等［12］的研究則發(fā)現(xiàn)，DM96系統(tǒng)識別分葉核中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞以及幼稚細胞與人工鏡檢的一致性分別為98.6%、93.5%、84.7%、95.2%、94.0%、78.5%，而桿狀核中性粒細胞的一致性較差，為22.9%。在分析時間方面，該研究也對不同自動形態(tài)分析儀進行了比較，Octavia系統(tǒng)和DM96系統(tǒng)對每張涂片進行100個白細胞的分析，平均耗時分別為5.4 min和3.2 min，而研究中較為熟練的人工操作則平均需要約4 min 的時間［12］。

自動數(shù)字圖像分析技術(shù)節(jié)約了實驗室工作人員的時間，便于教學和遠程讀片會診［13］。可以將這種血細胞自動數(shù)字圖像分析工作系統(tǒng)納入到血液細胞自動分析的流水線中，使得整個流程更為合理、便捷和標準化，這是未來現(xiàn)代化臨床實驗室的一種理想模式。應注意的是，這種數(shù)字圖像分析系統(tǒng)僅是一種預分類方法，人工確認仍是保證準確診斷的不可缺少的重要環(huán)節(jié)。自動化與可視化技術(shù)的目的并非為了以機器分類替代人工識別，而是提高了涂片效率，增加了預篩選步驟，為讀片工作節(jié)約了更多的時間。

總之，可以預見，新的技術(shù)還會不斷涌現(xiàn)，血液細胞的分析工作將會變得更為便捷、準確。自動化、流水線化、可視性增強使得人工操作繁瑣費時的狀態(tài)得到進一步改善。對血細胞表面或內(nèi)部標志物的分析，可以使其分類得到進一步細化，以分子分型實現(xiàn)了傳統(tǒng)人工鏡檢所不能做到的分類方式，同時還可以對特定類型血細胞的功能進行了解。但同時也應注意，無論技術(shù)怎樣發(fā)展，自動化分析儀器總有其內(nèi)在不足，人工鏡檢是血液細胞分析中的重要部分，具有自動儀器檢測所不能替代的直觀、實用和經(jīng)濟優(yōu)勢。不斷發(fā)展的自動化分析技術(shù)與傳統(tǒng)的人工鏡檢相互結(jié)合，才會真正更加有利于對疾病的準確診斷和對病情的合理判斷。

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