李 雯，王秀華

(東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱150040)

榆樹，雙子葉植物，樹皮粗糙，具實用及藥用價值，主要用于造林、綠化;榆樹嫩果和幼葉可以食用或作飼料，同時可入藥等。榆屬常見樹種為白榆、春榆、脫皮榆和黃榆等，其適應性極強，喜光、耐寒、耐旱、耐瘠薄，不擇土壤［1］;根系發(fā)達，抗風力、保土力強;萌芽力強，耐修剪;生長快，壽命較長。

近年來，隨著對榆樹研究的發(fā)展和深入，傳統(tǒng)的育種工作受到了分子生物學等最新研究成果的沖擊，國內外許多研究已轉向遺傳學基礎研究［2－4］，但有一系列問題尚未解決，本文總結榆屬常見樹種組織培養(yǎng)近況，討論不同培養(yǎng)基及激素對其愈傷組織誘導、分化及生根的影響，獲得高效率的外植體再生體系，為今后榆樹基因工程改良作物提供理論依據和基礎材料。

1 材料的選取與處理

1.1 材料的選取

組織培養(yǎng)的選材很重要，會直接影響實驗效果。外植體的選材應充分考慮取材部位、大小和供體植株的生理狀況等因素，因為植物細胞具有全能性，理論上講選用植株的任何部位都能誘導成株，但是實驗表明，植株的不同部位誘導結果還是有很大差別的，因此在選取外植體時應挑選誘導能力強的，如幼葉、莖段、莖尖和腋芽［5］等。

榆樹組織培養(yǎng)材料選取通常有兩種途徑［6］:一種是直接取自野生植株不同部位作為外植體。另外一種是利用榆樹種子萌發(fā)，然后取無菌苗的不同部位作為外植體，第二種方法的優(yōu)點是減少了外植體染菌的機率，提高了實驗效率。

1.2 材料的采摘與處理

實驗如果選取野生植株作為外植體，盡量選取植株生長旺盛且氣溫較涼爽的季節(jié)，通常4～5月份取材比較適宜。如王靜華、侯建生等人取白榆當年生健壯帶芽莖段［7］;圖亞等人取黃榆的葉片［8］;林靜芳取春榆樹冠中部新梢切斷作為外植體材料［9］，通常剪成2㎝左右長，先對材料進行預處理，用洗衣粉清洗其表面灰塵及部分菌體，再用自來水沖洗30～45 min。然后將清洗后的外植體在超凈工作臺上，用75%酒精浸泡30 s，2%次氯酸鈉消毒液浸泡3～5 min，無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸去水分，接種于激素濃度合適的基本培養(yǎng)基上，其中滅菌時間要根據材料的不同適量調整，時間短易造成材料消毒不充分而致初代培養(yǎng)時污染率高，時間過長則可能造成外植體的黃化和褐化。

實驗如果選取種子進行萌發(fā)，在當年5～6月間，當榆樹的果實由綠色變?yōu)辄S白色、中部隆起即可采收，種子質量應達到GB7908林木種子質量分級規(guī)定的I級和II級標準［10］，放于通風處自然陰干，隨采隨用，同樣用洗衣粉清洗其表面，再用自來水沖洗3～5 h。然后將清洗后的種子在超凈工作臺上，用75%酒精浸泡1 min，5%次氯酸鈉消毒液浸泡8～10 min，無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸去水分，接種到不添加任何激素的基本培養(yǎng)基上，待其長出無菌苗即可取材實驗。

2 培養(yǎng)基的選擇與激素調節(jié)

2.1 培養(yǎng)基的篩選

植物組織培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)成分全部來自培養(yǎng)基，其供應狀況直接關系到培養(yǎng)物的生長與分化，因此了解培養(yǎng)基的成分、特點及其配制至關重要。通過眾多人實驗，如圖亞通過對蒙古黃榆的愈傷組織誘導過程中的比較發(fā)現，MS培養(yǎng)基誘導率明顯比LP、DCR培養(yǎng)基高，且愈傷產生的情況及生長狀況也較優(yōu)［11］;張建鋒、彭冶、唐曉杰、林靜芳等人通過實驗對比發(fā)現，白榆、金葉榆和春榆等的最適增殖培養(yǎng)基也為 MS 和 1/2MS 培養(yǎng)基［9，12－14］。因此榆樹組織培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基為MS，培養(yǎng)基加蔗糖20 g/l，瓊脂6.5 g/l，附加不同的濃度及不同種類的激素。

2.2 激素種類及濃度的影響

激素在植物組織培養(yǎng)中起著關鍵作用，因此正確的選擇適合的激素及對激素使用量的控制很重要。

2.2.1 激素種類

從榆屬常見樹種的組培結果來看，增殖培養(yǎng)基通常為MS+6－BA+IBA，6－BA可以高效的從頂芽、側芽和莖段誘導芽增殖。具體要根據材料地域不同進行試驗;最適的生根培養(yǎng)基通常為MS或者1/2 MS+IBA，從生根率看，MS普遍比1/2MS效果好，在葉片、胚軸作為外植體誘導不定芽時，TDZ通常比6－BA誘導率高;2，4－D，KT等激素也被用于榆樹組培中，但是誘導效果不明顯，被證明不適合榆屬組織培養(yǎng)，在黃榆、春榆的生根培養(yǎng)中，添加NAA有利于生根率的提高，但是在白榆的培養(yǎng)基中添加NAA很容易玻璃化，生根率低，是否因為白榆對NAA比較敏感沒有具體研究。另外通常往培養(yǎng)基中添加少量的赤霉素來防止小植株基部形成愈傷組織而導致成活率下降［15］。

2.2.2 激素濃度配比范圍

經王靜華等人實驗證明，最適白榆增殖培養(yǎng)基是MS+6－BA 0.10mg/l+IBA 0.005mg/l，同時其也添加少量NAA，但是白榆極易產生玻璃苗。最適生根培養(yǎng)基是MS+IBA 0.01mg/l;葉片再生最適培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.005mg/l+IAA 0.005mg/l，但是葉片再生能力較弱，有待進一步研究［16］。杜盛等人經多次試驗發(fā)現最適合脫皮榆的增殖培養(yǎng)基為MS+(1.5 ～2.0)mg/l BAP+0.01mg/l NAA［17］;唐曉杰在對金葉榆組培中證明，MS+6－BA 1.0mg/l+IBA 0.1mg/l培養(yǎng)基中不定芽增殖數量最多［14］。

綜上，增殖培養(yǎng)基通常濃度配比范圍為6－BA(0.1～2.0)mg/l，IBA(0.005 ～0.1)mg/l，具體要根據材料地域不同進行試驗，選取合適的濃度范圍進行培養(yǎng);最適的生根培養(yǎng)基IBA通常濃度范圍(0.01～1.0)mg/l，IBA濃度增加，根會變粗壯，但當IBA濃度超過1.0mg/l時，就會抑制根伸長，有毒物質積累，出現瘤狀物，因此要根據具體材料調節(jié)濃度。

3 組織培養(yǎng)中的其他影響因素

3.1 溫度 光照的影響

研究表明，榆樹培養(yǎng)室溫度應控制在25±2℃，溫度過高不利于生長，容易長菌;溫度過低，不利于光合作用。光照強度2000～3000 Lx，光照時間為10 h［7］，同時配合8～10 h的暗處理對初始誘導有更好的效果，因為愈傷組織最初出現芽體需在黑暗中培養(yǎng)［18］，然后再光下進一步培養(yǎng)產生大量芽體，具體時間還要根據材料靈活選擇。

3.2 pH的選擇

榆樹最適pH為5.8～6.0，符合其野外生長土壤環(huán)境，微酸性環(huán)境下幼苗生長有利，存活率較高。同時在配置培養(yǎng)基時，要充分考慮到滅菌前后pH變化而進行調試，防止因為滅菌過后pH降低，影響培養(yǎng)基質量。

3.3 培養(yǎng)基中的C/N

培養(yǎng)基中蔗糖，為培養(yǎng)物的生長發(fā)育提供所需的能量和底物，同時也影響植物的滲透勢;反過來，培養(yǎng)基的滲透勢也對培養(yǎng)物的代謝起調節(jié)作用。

李天珍、李保堂等人通過對白榆新稍生根的研究發(fā)現，當培養(yǎng)基的蔗糖濃度較低時，根系的發(fā)生主要受能量和底物供給的限制，滲透勢的調節(jié)則處于次要地位，隨著蔗糖濃度的提高，能量和底物的供給達到飽和，這時蔗糖濃度再進一步提高，起到了調節(jié)滲透勢的作用，同時促進生根。在培養(yǎng)基中加入NO3－或NH4+作為氮源時，在測試范圍內對生根有抑制作用，降低新稍的生根率。結果表明，含有高濃度蔗糖的培養(yǎng)基比低濃度蔗糖的培養(yǎng)基生根率高。即C/N比高有利于生根［19］。

因此在生根實驗中，應特別注意在合適范圍內適當提高C/N比，高濃度的蔗糖有利于提高生根率。

4 白榆組織培養(yǎng)的生根問題

4.1 試管內生根

實驗證明，王靜華在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中也可以讓白榆生根但生根率較低，添加IBA后更適合生根，且平均莖高、平均根長、生根率和生根系數均高于不添加任何激素的培養(yǎng)基［7］。將長勢較好的試管苗接種，待新稍長到30～40 mm左右時，如唐曉杰等在金葉榆試管苗長出3～5條不定根，根長1.5 cm時［14］，在培養(yǎng)室內打開培養(yǎng)瓶口煉苗2～3 d，煉苗過程需注意補水，防止幼苗缺水干枯。

4.2 試管外生根和移栽

煉苗結束后取出植株，洗凈根上的瓊脂，在10%多菌靈溶液中浸泡15～20 min后扦插到裝有蛭石+珍珠巖+草炭土=1∶1∶1的花盆中，因為蛭石和珍珠巖透水透氣性好，而草炭土能提供充分的營養(yǎng)，此基質組合為最佳［11］。開頭3～5 d暗處理，以后逐漸增加光照，不斷澆水，15～20 d左右檢查，看生根情況，進行統(tǒng)計生根率和成活率。

組織培養(yǎng)中試管內生根有一定的弊端，生根不旺盛，容易感染雜菌，移栽過程中容易死亡，導致移栽存活率較低。因此試管外生根將試管苗生根和馴化結合起來，大大提高了繁殖系數，有利于大規(guī)模培養(yǎng)。

5 展望

組織培養(yǎng)由于具有縮短育種時間、提高植物品質以及保存物種等優(yōu)點，已經在很多植物中獲得成功。近些年來，通過對不同外植體的誘導已經獲得了不同種榆的再生植株，但是榆樹的組織培養(yǎng)體系并不是完全成熟，存在一些急需解決的問題:比如在組培過程中，外植體經常存在褐變現象，有研究稱褐變主要是PPO作用于天然底物酚類物質而引起的，因此在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和其他抑制劑可以抑制褐變［20］，陳學森等在銀杏組織培養(yǎng)中應用植酸作抗氧化劑，取得了一定成效［21－23］。但是具體的是否適用于榆樹組培還有待進一步研究;在繼代培養(yǎng)中出現玻璃化苗、白化苗等現象的具體原因以及克服方法也還沒有明確的研究。

因此在愈傷組織分化時，根據內源激素的要求，在培養(yǎng)基中添加合適的外源激素來進行調節(jié)，從再生角度考慮，繼續(xù)擴大基因型篩選范圍，尋找對再生敏感的基因型［17］是今后努力的方向，相信通過不懈努力，榆樹的組織培養(yǎng)工作將會取得更大的成績，使其綜合利用價值更高。

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