曹毅 翁鶴 楊曉紅

白念珠菌(Candida albicans)又稱(chēng)白假絲酵母菌，廣泛存在自然中，是人類(lèi)和動(dòng)物共患的深部條件性致病菌，寄居于皮膚、口腔、胃腸道等部位，通常情況下并不引起發(fā)病。而在菌群失調(diào)或宿主免疫力低下時(shí)大量繁殖，轉(zhuǎn)為致病形態(tài)，形成病灶，引起皮膚、粘膜及內(nèi)臟的念珠菌病，嚴(yán)重的深部白念珠菌感染可危及病人的生命［1-2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，深部白念珠菌感染病死率高達(dá)68．9%。目前，隨著艾滋病的傳播，癌癥放化療的開(kāi)展、器官移植后免疫抑制劑的應(yīng)用，以及導(dǎo)管等越來(lái)越多生物材料的應(yīng)用，白念珠菌感染率不斷增加，并發(fā)生反復(fù)感染，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)上備受關(guān)注的問(wèn)題［3-4］。臨床上主要以三唑類(lèi)藥物進(jìn)行治療和預(yù)防［5］，該類(lèi)藥物的作用方式為抑菌作用，因此療程長(zhǎng)，在長(zhǎng)期使用過(guò)程中逐漸使耐藥真菌比例增多或出現(xiàn)耐藥突變。在有限的藥物資源條件下，醫(yī)藥工作者試圖通過(guò)個(gè)體化用藥、聯(lián)合用藥和應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑等策略克服白念珠菌耐藥問(wèn)題，其中，探索科學(xué)的聯(lián)合用藥方案、開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物和抗菌增效劑是公認(rèn)的最有效的策略。

大量中藥被證實(shí)具有明確的抗真菌作用，且副作用小、來(lái)源廣、價(jià)格低廉和較少出現(xiàn)耐藥。因此，研究開(kāi)發(fā)抗真菌中藥具有良好前景［6-7］。筆者所在的課題組發(fā)現(xiàn)中藥黃連解毒湯不僅具備良好的抗真菌活性(須癬毛癬菌和白念珠菌的平均最小抑菌濃度值分別為0．0034 g/ml 和0．017 g/ml)，同時(shí)該藥與西藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，可明顯提高西藥的抗真菌作用，增加真菌對(duì)藥物的敏感性，具有良好的增效作用［7］。但是目前對(duì)其本質(zhì)的認(rèn)識(shí)尚存在空白，因而制約了其發(fā)展，同時(shí)也潛在著廣闊的研究?jī)?nèi)容，目前在國(guó)家自然科學(xué)基金的支持下，課題組已啟動(dòng)建立了與高通量活性篩選相結(jié)合的黃連解毒湯抗白念珠菌生物學(xué)機(jī)制的分析研究體系，以下將介紹有關(guān)基本情況。

1 三唑類(lèi)抗真菌藥物抗白念珠菌的機(jī)制及耐藥情況

目前，臨床上廣泛應(yīng)用的抗真菌藥物為三唑類(lèi)(如酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等)、兩性霉素B 和5-氟胞嘧啶［5］。5-氟胞嘧啶能引起胃腸道反應(yīng)、一過(guò)性轉(zhuǎn)氨酶升高、堿性磷酸酶升高及白細(xì)胞和血小板減少等不良反應(yīng)，同時(shí)能快速產(chǎn)生5-氟胞嘧啶耐藥菌株，因此該藥很少用于臨床治療深部真菌感染;兩性霉素B 無(wú)論口服還是肌肉注射均難吸收，大部分藥劑在體內(nèi)代謝滅活，不易透過(guò)血腦屏障，并且在體內(nèi)消除緩慢，引起較多不良反應(yīng)，最常見(jiàn)包括靜滴藥物后寒戰(zhàn)、高熱等即刻反應(yīng)以及貧血、肝腎毒性、低血鉀等。且該藥腎毒性大，并呈劑量依賴(lài)性，約80%患者發(fā)生氮質(zhì)血癥，這些因素大大限制了該藥在臨床上作為常規(guī)藥物的應(yīng)用。三唑類(lèi)抗真菌藥物是目前使用最廣泛的一類(lèi)抗真菌藥物，其中，酮康唑是最先使用的口服藥，而現(xiàn)在多被更有效低毒的三唑類(lèi)衍生物如氟康唑和伊曲康唑等取代。氟康唑?yàn)閺V譜抗真菌藥，其抗菌譜與酮康唑相似，體內(nèi)抗真菌作用比酮康唑強(qiáng)10 ～20 倍。除對(duì)氟康唑具有天然耐藥性的克柔氏念珠菌和光滑念珠菌外，氟康唑?qū)ζ渌钪榫?、隱球菌、毛孢子菌屬、毛癬菌屬、皮炎芽生菌及粗球孢子菌等均比較敏感。因其吸收好、給藥方便、抗菌譜廣、療效高和毒副作用小等特點(diǎn)，是目前臨床上治療白念珠菌感染的首選藥物，得到廣泛應(yīng)用［8］。伊曲康唑能優(yōu)先與角蛋白組織(如指甲、頭發(fā)和皮膚)結(jié)合，因此在治療淺表、皮下真菌感染方面有良好的療效。該藥對(duì)非白念珠菌和曲霉菌屬的真菌有廣譜抗菌活性。然而其口服吸收差，在臨床深部真菌感染治療效果受限制，因此該藥主要作為侵襲性曲霉菌病的二線用藥及組織胞漿菌病和皮炎芽生菌病的一線用藥。

由于目前日益嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象和有限的治療藥物使白念珠菌感染成為臨床上迫切需要解決的問(wèn)題。因此，深入研究真菌的生化反應(yīng)機(jī)制和耐藥機(jī)理已經(jīng)成為必要。研究人員發(fā)現(xiàn)，臨床產(chǎn)生耐藥的原因主要包括細(xì)胞間藥物量積累的減少、藥物對(duì)靶標(biāo)蛋白結(jié)合力降低、靶標(biāo)表達(dá)水平增高以及麥角甾醇合成途徑的改變等［9-10］。Dunkel 等［11-13］發(fā)現(xiàn)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括ATP 結(jié)合盒式蛋白(ATP-bindingcassette transporter，ABC)的CDR1 和CDR2 基因，及編碼易化擴(kuò)散載體超家族(major facilitator superfamily，MFS)蛋白的MDR1 基因等過(guò)量表達(dá)，引起大量藥物快速排除真菌細(xì)胞，使細(xì)胞間藥量積累水平明顯降低，這是造成真菌耐藥的重要原因之一。Clemens 等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)量表達(dá)是由于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生點(diǎn)突變引起的，因此，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子點(diǎn)突變是致使真菌產(chǎn)生耐藥性的深層次原因。目前，已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子點(diǎn)突變包括A643T、G648D 等［14-15］。Lamb 等發(fā)現(xiàn)三唑類(lèi)藥物靶標(biāo)蛋白ERG11 點(diǎn)突變后，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使藥物對(duì)靶標(biāo)蛋白的結(jié)合力降低，造成真菌耐藥［16］。目前，已發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變包括F126L、G129A、Y132H、T229A、G307S、S405F、F449S、G464S、G465S、R467K、I471T 等［10，17-18］。ERG11 表達(dá)量增高是真菌耐藥的另一個(gè)重要原因。Marichal 等［19］發(fā)現(xiàn)C．glabrat 耐藥菌株中ERG11 基因存在多個(gè)拷貝，Heilmann 等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子UPC2p 點(diǎn)突變能調(diào)控ERG11 表達(dá)量增加，引起耐藥現(xiàn)象［12］。此外，Chau等［16-20］研究發(fā)現(xiàn)ERG3 突變?cè)斐晒δ苋笔?，引起麥角甾醇合成途徑的改變，也能引起真菌耐藥。分子流行學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)耐藥機(jī)制可同時(shí)存在于一個(gè)耐藥菌株中。Wirsching 等［15］證實(shí)一個(gè)白念真菌菌株的耐藥是由于MDR1 基因表達(dá)上調(diào)和ERG11 蛋白G463S 點(diǎn)突變共同造成的。

2 中藥黃連解毒湯在抗白念珠菌方面的研究前景分析

中醫(yī)學(xué)中有大量中藥被證實(shí)具有明確的抗真菌作用，且中藥具有副作用小、來(lái)源廣、價(jià)格低廉和較少出現(xiàn)耐藥等優(yōu)點(diǎn)，因此，研究開(kāi)發(fā)抗真菌中藥具備良好前景［6-7］。中藥具有很多活性強(qiáng)而副作用小的有效成分，許多化合物結(jié)構(gòu)新穎，與現(xiàn)有藥物完全不同，因此從中藥中尋找抗真菌新藥或先導(dǎo)化合物，是近年中藥研究的熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的具有抗真菌作用的中藥及其單體主要包括粉防己［21］、吳茱萸［22］、黃芩苷［23-24］等。黃杉等［23］發(fā)現(xiàn)聯(lián)用黃芩苷和氟康唑可以有效抑制氟康唑耐藥的白念珠菌株生長(zhǎng)，目前一般認(rèn)為黃芩苷對(duì)白念珠菌生物膜形成有抑制作用［24］。

黃連解毒湯，首載于葛洪《肘后備急方》，是中醫(yī)藥中已發(fā)現(xiàn)的具有良好抗菌作用的藥劑之一，由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，具有清熱、瀉火、解毒之功效，主治一切實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證。現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為黃連解毒湯具有良好的抗菌作用，除對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型鏈球菌、變形桿菌、痢疾桿菌和大便產(chǎn)堿桿菌等多種細(xì)菌有明顯抑制作用外，對(duì)白念珠菌懸浮菌亦具有良好的抑制作用，其最小抑菌濃度范圍為0．0016 ～0．0063 g/ml［19］。此外，臨床應(yīng)用黃連解毒湯浸泡治療足癬也取得良好的治療效果，總有效率高達(dá)82．5%。因此，從表型實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)顯示，黃連解毒湯有良好的抑菌效果，并極大增強(qiáng)西藥殺菌作用。但基本未涉及分子機(jī)理的研究，比如:白念珠菌受黃連解毒湯處理時(shí)，響應(yīng)的關(guān)鍵基因是什么，以及其信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)等。由于幾乎沒(méi)有其他可參考的數(shù)據(jù)，因此，構(gòu)筑數(shù)據(jù)平臺(tái)、提供參考線索，是挖掘黃連解毒湯對(duì)白念珠菌作用機(jī)制的先決條件，而采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)錄組的變化是一個(gè)快速有效的解決方案。充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法進(jìn)行高效快速的黃連解毒湯抗白念珠菌的藥效和作用機(jī)理的研究，不但是挖掘、發(fā)展和完善中醫(yī)藥寶庫(kù)的迫切需要，而且是中藥現(xiàn)代化研究中急需解決的根本問(wèn)題。

3 高通量測(cè)序技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用

3．1 基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展

基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展大體上可分為三代，第一代為毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)，第二代為高通量測(cè)序技術(shù)，第三代為單分子測(cè)序技術(shù)。目前，國(guó)外憑借其高通量基因測(cè)序技術(shù)和測(cè)序設(shè)備的研發(fā)優(yōu)勢(shì)，利用基因資源的唯一性，搶先申請(qǐng)基因?qū)＠?，謀求壟斷未來(lái)全球的基因產(chǎn)業(yè)。而高通量基因測(cè)序技術(shù)的研究在中國(guó)目前處于起步階段，具有非常重要的迫切性。在未來(lái)，生物醫(yī)藥、臨床醫(yī)療等領(lǐng)域的開(kāi)展都將建立在現(xiàn)代的基因測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)上，尤其在基因診斷和基因治療方面。

3．2 毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)

在1977 年，Sanger 等提出了經(jīng)典的雙脫氧核苷酸末端終止測(cè)序法，在Sanger 法的基礎(chǔ)上，1986 年美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)推出世界上第一臺(tái)全自動(dòng)電泳測(cè)序儀，以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號(hào)接收器和計(jì)算機(jī)信號(hào)分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動(dòng)測(cè)序儀，也把該研究成果發(fā)表在雜志《Nature》上。毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)使得人類(lèi)獲取全基因組圖譜的夢(mèng)想得以實(shí)現(xiàn)，1990 年美國(guó)國(guó)會(huì)正式批準(zhǔn)了人類(lèi)基因組計(jì)劃(1990 年)。人類(lèi)基因組計(jì)劃耗時(shí)13 年，耗資約30 億美元，完成了由30 億個(gè)堿基對(duì)組成的人類(lèi)基因組DNA 關(guān)鍵序列圖的測(cè)序工作，中國(guó)于1999 年9 月加入國(guó)際人類(lèi)基因組計(jì)劃，承擔(dān)該次人類(lèi)基因組計(jì)劃1%工作，用6 個(gè)多月的時(shí)間完成了人類(lèi)第3 號(hào)染色體短臂從D3S3610 至端粒的30 Mb 區(qū)域上3000 萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序任務(wù)。目前國(guó)內(nèi)從事毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)的有關(guān)院校和單位有中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)科技大學(xué)與臺(tái)灣國(guó)立成功大學(xué)、國(guó)立中山大學(xué)、浙江大學(xué)、福建師范大學(xué)、中山大學(xué)等。

3．3 高通量測(cè)序技術(shù)

雖然毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類(lèi)基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但是存在成本高、速度慢等方面的不足。高通量基因測(cè)序技術(shù)是對(duì)毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)一次革命性的改變，該技術(shù)的特點(diǎn)是可以對(duì)大量DNA或RNA 直接測(cè)序，并通過(guò)測(cè)序結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)基因組序列(本物種或其他相近)的分析比對(duì)，在轉(zhuǎn)錄水平上確認(rèn)基因的表達(dá)量，即獲得精確的數(shù)字表達(dá)譜及具體響應(yīng)基因。第一個(gè)推向市場(chǎng)的高通量基因測(cè)序儀是2005 年10 月由美國(guó)的454 Life Sciences 公司推出的GS20。高通量測(cè)序設(shè)備具有極高的測(cè)序通量，相對(duì)于第一代的96 道毛細(xì)管電泳測(cè)序儀，高通量測(cè)序一次實(shí)驗(yàn)可以讀取相當(dāng)于40 萬(wàn)到400 萬(wàn)條通道的序列。讀取長(zhǎng)度根據(jù)各個(gè)公司的高通量基因測(cè)序儀不同，從25 bp 到450 bp，不同的測(cè)序儀在一次實(shí)驗(yàn)中，可以讀取1 G 到14 G 不等的堿基數(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)的強(qiáng)大快速測(cè)序能力使得對(duì)一個(gè)物種的RNA 轉(zhuǎn)錄組、全基因組進(jìn)行功能分析等成為可能。自2007 年1 月Illumina 公司新一代高通量測(cè)序儀Solexa 正式商業(yè)化使用以來(lái)，國(guó)際權(quán)威期刊《Nature》和《Science》已有多篇論著報(bào)道新一代高通量測(cè)序儀成功測(cè)定物種的基因及轉(zhuǎn)錄組。Liu等［25］應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析三唑類(lèi)藥物戊唑醇處理后禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)基因表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇生物合成途徑中的多個(gè)基因表達(dá)量明顯上升，極大地響應(yīng)了藥劑的處理。中國(guó)第一臺(tái)高通量測(cè)序儀是深圳華因康基因科技有限公司在2008 年10 月推出，第二代高通量測(cè)序儀的測(cè)序能力在不斷得到提高，而測(cè)序費(fèi)用在不斷的降低。2007 年，美國(guó)國(guó)立人類(lèi)基因組研究會(huì)提出利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，測(cè)序個(gè)人基因組只需花費(fèi)1000 美元的目標(biāo)。

3．4 單分子測(cè)序技術(shù)

單分子測(cè)序技術(shù)作為未來(lái)的第三代測(cè)序技術(shù)，它將是分子影像技術(shù)、納米技術(shù)等多項(xiàng)技術(shù)的結(jié)晶。分子影像技術(shù)可以在細(xì)胞、基因和分子水平上實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)部生理或病理過(guò)程的無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)在體成像，而納米技術(shù)應(yīng)用于分子影像學(xué)的根本目的就是為增強(qiáng)熒光分子探針識(shí)別特異性靶分子的能力，提高分子顯像效果，實(shí)現(xiàn)微觀機(jī)理的可視化，但是目前單分子測(cè)序技術(shù)尚未商業(yè)化。

4 高通量測(cè)序技術(shù)在黃連解毒湯對(duì)白念珠菌作用機(jī)制方面的應(yīng)用前景

由于使用高通量測(cè)序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同組織mRNA 表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與基因組進(jìn)行比較可以確定組織特異表達(dá)的基因，因此具有取代“基因芯片”技術(shù)的態(tài)勢(shì)。由于基因芯片的檢測(cè)范圍取決于芯片上探針的信息，因此只能檢測(cè)人們已知序列的特征，缺乏發(fā)現(xiàn)尋找新，基因的能力，而高通量測(cè)序則能夠很好地彌補(bǔ)基因芯片這方面的不足，因此在未來(lái)的幾年中，高通量測(cè)序技術(shù)將會(huì)取代“基因芯片”越來(lái)越成熟并得到更加廣泛的應(yīng)用。

因此認(rèn)為可以以新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為契機(jī)，應(yīng)用該技術(shù)測(cè)定黃連解毒湯處理白念珠菌過(guò)程中菌株轉(zhuǎn)錄組的變化，采用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析、整理和歸類(lèi)，識(shí)別其中的響應(yīng)基因及網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，結(jié)合特異性熒光定量PCR 法的大樣本驗(yàn)證工作及基因敲除等研究手段，觀察敲除關(guān)鍵基因后的突變白念珠菌對(duì)黃連解毒湯敏感性、致病性、生長(zhǎng)特性和抗逆性等表型的改變，詳細(xì)鑒定關(guān)鍵基因功能。另外，利用臨床分離到的黃連解毒湯白念珠菌抗性和敏感菌株，測(cè)定關(guān)鍵基因序列，并采用真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，觀察含有點(diǎn)突變的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)化子對(duì)黃連解毒湯抗性的變化，以期明確黃連解毒湯對(duì)白念珠菌的作用機(jī)理及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從理論上闡明黃連解毒湯對(duì)西藥的增效作用。有助于真菌臨床耐藥問(wèn)題監(jiān)測(cè)工作的開(kāi)展，并為新藥物開(kāi)發(fā)和新型治療方案研制提供理論依據(jù)，同時(shí)為古方的現(xiàn)代化應(yīng)用提供新的研究思路，必將產(chǎn)生較大的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。

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