雷蘭萍，魏毅君，熊紅燕，楊 陽，陳 濤，金振曉

·基礎研究·

烏司他丁對外源性過氧化氫介導內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

雷蘭萍，魏毅君，熊紅燕，楊 陽，陳 濤，金振曉

目的研究烏司他丁對外源性過氧化氫介導的內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。方法 體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）培養(yǎng)液中加入外源性過氧化氫（250 μmol/L）制作內(nèi)皮細胞損傷模型，加入不同濃度的烏司他?。?00、500、1 500、3 000和5 000 U/ml），MTT法檢測內(nèi)皮細胞存活率，同時檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性、一氧化氮含量和彈性蛋白酶活性，并測定內(nèi)皮細胞黏附能力。結果 外源性過氧化氫可以顯著降低內(nèi)皮細胞存活率，同時培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高、一氧化氮含量顯著降低、彈性蛋白酶活性顯著升高，內(nèi)皮細胞黏附能力下降。烏司他丁雖然可以在一定程度上抑制細胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性的升高，但是對細胞存活率、LDH的釋放、一氧化氮的釋放、細胞黏附能力均無明顯改善作用。結論 本研究采用的烏司他丁劑量對外源性過氧化氫介導的內(nèi)皮細胞損傷無明顯保護效果。

烏司他??；內(nèi)皮細胞；過氧化氫；彈性蛋白酶

血管內(nèi)皮細胞介于血液與組織間，發(fā)揮著屏障作用，同時具有多種生理功能，對維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著積極作用。內(nèi)皮功能異常是II型糖尿病患者血管并發(fā)癥的始發(fā)因素[1]。氧化應激是糖尿病患者血管內(nèi)皮功能異常的重要原因[2]?？寡趸委煂τ陬A防和治療糖尿病性血管病變具有重要的臨床意義[3]。內(nèi)皮細胞氧化應激過程中，會出現(xiàn)溶酶體膜不穩(wěn)定和溶酶體內(nèi)蛋白酶的釋放，是氧化應激造成內(nèi)皮細胞損傷的重要機制。采用適當措施穩(wěn)定溶酶體膜并對抗這些蛋白酶對細胞內(nèi)結構和細胞膜結構的溶解破壞作用是對抗氧化應激損傷的重要方法。目前，臨床上最常用的蛋白酶抑制劑是烏司他丁，烏司他丁是一種從正常男性尿液中提取的蛋白酶抑制劑，常用于對抗過度炎癥反應引起的各種組織損傷[4]。本研究的主要目的是觀察烏司他丁是否能在體外抑制過氧化氫介導的內(nèi)皮細胞損傷，并初步探討其對內(nèi)皮細胞的保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑、細胞與儀器 重組人腫瘤壞死因子α（rhTNF-α）（R＆D公司，美國），干擾素γ（IFN-γ）（R＆D公司，美國），烏司他?。◤V州天普藥業(yè)公司）。人臍靜脈內(nèi)皮細胞株由第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心血管外科實驗室提供，小牛血清（杭州四季青公司），DMEM低糖培養(yǎng)液（Hyclone，美國），胰蛋白酶（Sigma，美國），MTT（Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所），彈性蛋白酶活性的檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），DMSO（Sigma，美國），細胞裂解液（碧云天，上海）。彈性蛋白酶細胞熒光探針AAPV Elastase CellProbeTMReagent（Beckman公司，美國）。CO2細胞培養(yǎng)箱（Forma，美國），酶標儀（Biotech，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設備儀器廠），倒置顯微鏡（O-lympus，日本），低速離心機（賽特湘儀，湖南）。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的培養(yǎng)、準備與實驗分組 HUVECs用含10％小牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。待細胞融合后，用0.25％胰蛋白酶消化。鏡下觀察到細胞收縮變圓時棄去消化液，加入培養(yǎng)液以終止胰蛋白酶的作用。用滴管吹打壁上的細胞，使其完全脫落并分離。根據(jù)實驗需要按2×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板中。待細胞融合后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步化，然后即可進行分組實驗。過氧化氫濃度為250 μmol/L，實驗分為7組：對照組，H2O2損傷組，H2O2+烏司他丁保護組（烏司他丁濃度分別為100、500、1 500、3 000和5 000 U/ml）。對照組，HUVECs在DMEM中孵育4 h；H2O2損傷組，HUVECs在含有H2O2的DMEM中孵育4 h；H2O2+烏司他丁保護組，HUVECs在含有H2O2和不同濃度烏司他丁的DMEM中孵育4 h。孵育完成后，收集培養(yǎng)液用于其它檢測。

1.3 MTT法檢測不同濃度烏司他丁對過氧化氫介導HUVECs損傷后細胞存活率的影響 加入DMEM培養(yǎng)液（100 μl）和含0.5％MTT的培養(yǎng)液（10 μl），37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入100 μl的DMSO原液，振蕩10 min，待結晶完全溶解后，同時用酶標儀于490 nm波長處測定吸光值（OD值），實驗重復3次。

1.4 培養(yǎng)液中LDH含量的測定 LDH試劑盒購至南京建成生物工程研究所，按照試劑盒說明書對上述收集到的培養(yǎng)液進行LDH含量檢測。實驗重復3次。

1.5 培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）含量的測定 以Griess法測定細胞培養(yǎng)液中NO含量[5]。方法簡述如下：100 μl細胞培養(yǎng)液與100 μl的Griess試劑（1％磺胺溶于2.5％磷酸與等體積的0.1％萘乙二胺鹽酸鹽混合液）在室溫下反應10 min，在酶標儀上于540 nm測定吸光度。根據(jù)NaNO2的標準曲線，計算出細胞培養(yǎng)液中NO的含量。實驗重復3次。

1.6 培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性的檢測 培養(yǎng)液中中性粒細胞彈性蛋白酶活性采用顯色性底物方法檢測，彈性蛋白酶將其特異性底物N-methoxysucciny-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide分解后，釋放出pnitroanilide，即可在分光光度計測定其含量。方法簡述如下：培養(yǎng)上清液400 g離心10 min后，加入含有顯色底物和NaCl（0.5 M）的Tris-HCl（0.1 mM）緩沖液，37℃孵育10 min，0.1 M NaOH終止反應，彈性蛋白酶消化底物釋放出的p-nitroanilide的含量在405 nm波長分光光度計下檢測。以損傷組的平均OD值為1，其它各組培養(yǎng)液中彈性蛋白酶的活性表示為1的倍數(shù)。實驗重復3次。

1.7 黏附實驗測定細胞黏附能力 實驗方法參照文獻報道[6]，具體為：細胞種于50 ml培養(yǎng)瓶中，各組細胞處理4 h后，PBS洗3遍，用0.25％胰蛋白酶進行消化，離心、重懸后，每組細胞計數(shù)5×105/ml，種于96孔板，每組8個復孔。接種0.5 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)液（100 μl）和含0.5％MTT的培養(yǎng)基（10 μl），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，倒置顯微鏡拍照，不同觀察者對同一視野的細胞計數(shù)。實驗重復3次。

1.8 細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量測定 參照文獻報道[7]，ROS可以將非熒光的2′，7′-DCFH-DA轉化能發(fā)出熒光的DCFH。內(nèi)皮細胞接種在黑色96孔板中，進行分組處理后，PBS（pH 7.4）洗滌然后加入含有DCFH-DA（20 μM）的PBS，37°C孵育2 h.孵育結束后，F(xiàn)LX 800型微孔板熒光檢測儀（Biotech Instruments Inc.，USA）檢測熒光（波長530 nm）強度，激發(fā)光波長為485 nm。無細胞微孔為本底值。以對照孔的平均熒光強度為100，結果表示為對照孔熒光強度的百分比。

1.9 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學處理應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean SD）表示，采用Mann-Whitney檢驗進行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 MTT法檢測烏司他丁對H2O2致HUVECs損傷的保護 H2O2可以顯著降低內(nèi)皮細胞存活率，而本研究采用的烏司他丁劑量都沒有顯著提高內(nèi)皮細胞存活率。見圖1。

圖1 MTT法檢測不同處理組內(nèi)皮細胞存活率比較

2.2 培養(yǎng)液中LDH含量 各組細胞處理后檢測培養(yǎng)液中的LDH含量與單純DMEM孵育組相比，過氧化氫與HUVECs共孵育可引起培養(yǎng)液中LDH含量的顯著升高。本研究采用的烏司他丁劑量均未能顯著抑制過氧化氫與HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中LDH的升高。見圖2。

圖2 不同處理組內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中LDH含量比較

2.3 培養(yǎng)液中NO含量的檢測 各組細胞處理后檢測培養(yǎng)液中的NO含量，與單純DMEM孵育組相比，過氧化氫與HUVECs共孵育可以引起培養(yǎng)液中NO含量的顯著下降。本研究采用的烏司他丁劑量均未能顯著抑制過氧化氫與HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中NO含量下降。見圖3。

2.4 培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性的檢測 各組細胞處理后檢測培養(yǎng)液中的彈性蛋白酶的活性，對照組HUVECs的培養(yǎng)液中幾乎檢測不到彈性蛋白酶的活性，過氧化氫與HUVECs共孵育可以引起培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性顯著升高。超過3 000 U/ml的烏司他丁可有效抑制過氧化氫與HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性。見圖4。

圖3 不同處理組內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中NO含量比較

圖4 不同處理組內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性比較

2.5 黏附實驗測定細胞黏附能力 各組細胞處理后黏附0.5 h后細胞計數(shù)統(tǒng)計學分析，見圖5，結果表明H2O2可以有效降低內(nèi)皮細胞黏附能力，而不同濃度烏司他丁均未能顯著增加內(nèi)皮細胞黏附能力。

圖5 不同處理組內(nèi)皮細胞黏附能力的比較

2.6 細胞內(nèi)活性氧含量測定 各組細胞處理后檢測細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)含量，以對照組HUVECs中ROS含量為100，過氧化氫與HUVECs共孵育可以引起細胞內(nèi)ROS含量顯著升高。本研究采用的烏司他丁劑量未能有效抑制過氧化氫與HUVECs共孵育引起的細胞內(nèi)ROS含量的升高。見圖6。

圖6 不同處理組內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS含量的比較

3 討 論

H2O2能很容易地穿透細胞膜自由進入細胞，在細胞核內(nèi)的H2O2可轉變成具有高活性羥自由基，從而造成DNA鏈斷裂，導致細胞損傷[8]。LDH是細胞損傷后釋放到細胞外的細胞內(nèi)容物，其在細胞外的活力反映細胞損傷的程度[9]。本實驗中H2O2損傷組HUVECs培養(yǎng)液中LDH含量明顯升高，這表明H2O2能引起內(nèi)皮細胞損傷，同時抑制細胞的增殖代償能力。內(nèi)皮細胞的黏附能力也是血管內(nèi)皮損傷后修復能力的體現(xiàn)，本研究結果提示過氧化氫處理可以顯著降低培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的黏附能力，表明循環(huán)血液中氧化應激水平的升高確實可以對內(nèi)皮的損傷修復能力造成損害。內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧含量反映了細胞內(nèi)氧化應激的水平，而細胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶的含量反映的是內(nèi)皮細胞損傷后，溶酶體釋放的細胞溶解酶的釋放量。NO是由內(nèi)皮細胞合成的血管活性物質(zhì)，它具有舒張血管平滑肌，抑制異常增殖和炎癥反應，以及抑制血小板聚集等作用[10]。內(nèi)皮源性NO對心血管系統(tǒng)具有廣泛而明確的調(diào)控作用，維持正常的NO水平，對心血管保護作用具有重要的意義。II型糖尿病患者常有血管內(nèi)皮功能異常，內(nèi)皮源性NO表達減少[5]。

本實驗中不同劑量的烏司他丁雖然在一定程度上降低了細胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶的活性，但是不能對抗外源性H2O2損傷造成的內(nèi)皮細胞存活率下降，也不能抑制內(nèi)皮細胞LDH的釋放，不能抑制內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的升高，不能改善外源性過氧化氫損傷后內(nèi)皮細胞的黏附能力及提高培養(yǎng)液中的NO含量，提示烏司他丁對這種外源性過氧化氫造成的內(nèi)皮細胞損傷沒有明顯的保護作用。

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The protective effects of ulinastatin against exogenous H2O2-induced vascular endothelial cells injury

Lei Lan-ping，Wei Yi-jun，Xiong Hong-yan，Yang Yang，Chen Tao，Jin Zhen-xiao.
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi＇an 710032，China Corresponding author：Jin Zhen-xiao.Email：jinzx10262＠aliyun.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of ulinastatin on exogenous H2O2-induced vascular endothelial cells injury.MethodsIn vitro H2O2mediated endothelial cell injury model was established by adding H2O2（250 μmol/L）into the Human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）culture system.Serial concentrations（100，500，1 500，3 000 and 5 000 U/ml）of ulinastatin were added to the culture system.Cellular viability was determined with MTT assay；lactate dehydrogenase（LDH）content，NO content and elastase activity in the culture medium were examined.Cellular adhesive ability was also measured.ResultsThe co-culture process of H2O2and HUVECs significantly decreased the viability and adhesive ability of HUVECs，decreased the NO content and increased the LDH and elastase content in the culture medium.Ulinatatin inhibited the changes of medium elastase contents at some level，but had no significant effects on cellular viability and adhesive ability.It had no significant effects on the medium content of LDH，NO either.ConclusionUlinastatin，in the dose used in this study，has no significant protective effects on H2O2mediated endothelial cell injury.

Ulinastatin；Endothelial cell；H2O2；Elastase.

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0238-04

2013-07-15）

2013-07-26）

陜西省攻關計劃項目（2012SF2-21-1，2012K15-02-01）；天普研究基金項目（01201104）

710032西安，第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心血管外科（雷蘭萍、段維勛、楊 陽、陳 濤、金振曉）；721004寶雞，解放軍第三醫(yī)院神經(jīng)外科（魏毅君）；710003西安，西安市中心醫(yī)院胸心外科（熊紅燕）

金振曉，Email：jinzx10262＠aliyun.com