侯 元， 霍德勝， 劉永茂

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，吉林長(zhǎng)春130021)

0 引言

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高等學(xué)校教學(xué)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，是高等學(xué)校的生命線，也是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)際操作能力的重要環(huán)節(jié)［1］。實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法有多種，如:基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，綜合性實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)。基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)主要側(cè)重于對(duì)理論知識(shí)的理解和記憶，創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)是與驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)相對(duì)應(yīng)的，具有探索性和創(chuàng)造性的實(shí)驗(yàn)，其出發(fā)點(diǎn)是充分發(fā)揮學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性、主動(dòng)性和創(chuàng)造性，激發(fā)學(xué)生對(duì)科學(xué)技術(shù)的興趣，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力［2］。為此，我們結(jié)合臨床將科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，開(kāi)展了創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的方法和意義

目前，男性因素在不孕不育癥病因中占很大比例，精液分析在診斷男性不育及輔助生殖方面有重要作用。精液分析主要包括精子形態(tài)、密度和活力［3］。

1.1 精子細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)

精子形態(tài)是評(píng)價(jià)男性生育力的一個(gè)重要參數(shù)，資料表明正常精子形態(tài)(strict criteria)是體外受精主要預(yù)測(cè)參數(shù)，被認(rèn)為是衡量男性生育力的較好指標(biāo)［4］。

實(shí)驗(yàn)課上，教師首先提供給學(xué)生一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，即瑞士-吉姆薩染色法:標(biāo)本用生理鹽水洗滌3次，離心、涂片、晾干，用95%乙醇固定10 min，瑞士-吉姆薩染液染色30～60 s;加等量磷酸鹽染色5～8 min，流水沖洗后，置95%的乙醇中2～4 s，自然干燥后，用樹(shù)膠封片，結(jié)果顯示了精子的正常形態(tài)和異常形態(tài)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作，不但掌握了細(xì)胞染色技術(shù)，同時(shí)對(duì)觀察到的各種細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了極大的興趣，引發(fā)了他們的好奇心，引導(dǎo)他們進(jìn)一步的思考。比如，這些千奇百怪的異常形態(tài)是由什么因素造成的，有沒(méi)有其他更好的檢查方法。同學(xué)們主動(dòng)查閱各種資料尋找答案，最終發(fā)現(xiàn):目前，精子形態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，各國(guó)執(zhí)行的統(tǒng)一精子形態(tài)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)受到質(zhì)疑。并且多數(shù)對(duì)精子形態(tài)的分析，是在經(jīng)典光學(xué)顯微鏡的油鏡下觀察，主觀因素較大。一些參數(shù)無(wú)法檢測(cè)，亦不可能對(duì)大量樣本進(jìn)行分析?，F(xiàn)有報(bào)道用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA和ASMA)為精子形態(tài)、動(dòng)態(tài)分析提供了便利，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和客觀性［5］。隨后，學(xué)生走出教室，走進(jìn)臨床醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，采用WLJY-9000型彩色精子形態(tài)檢查系統(tǒng)人工修正方法分析精子形態(tài)。操作過(guò)程中精液凃片用改良巴氏染色。形態(tài)按系統(tǒng)設(shè)定程序分為11類，即形態(tài)正常精子、大頭精子、小頭精子、梨形頭精子、錐形頭精子、無(wú)定形頭精子、空泡樣頭精子、雙頭精子、頸部和中段缺陷精子、尾部形態(tài)缺陷精子，和其他形態(tài)缺陷精子。為提高閱片準(zhǔn)確性，同一份樣本由兩位檢測(cè)人員進(jìn)行精子形態(tài)分析。這一社會(huì)實(shí)踐活動(dòng)進(jìn)一步激發(fā)了學(xué)生們科學(xué)研究的熱情。

1.2 精子活率與活力測(cè)定

精子的成活率對(duì)于生育也是至關(guān)重要的。精子活率測(cè)定方法采用伊紅-Y染色法，即取精子標(biāo)本用伊紅Y染色，裝片，鏡檢，死精子呈紅色，活精子不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算得出活精子百分?jǐn)?shù)。

此實(shí)驗(yàn)在使學(xué)生掌握了細(xì)胞制片技術(shù)和顯微鏡使用方法的同時(shí)，進(jìn)一步了解精子運(yùn)動(dòng)特征對(duì)生育能力的影響。

Hirano等認(rèn)為，評(píng)估精子運(yùn)動(dòng)速度是預(yù)測(cè)受精率的有利參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)產(chǎn)WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)行精子活力分析。測(cè)定參數(shù)主要包括，精子曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、直線性(LN)、前向性(STR)、擺動(dòng)性(WOB)、頭部側(cè)擺幅度(ALH)、鞭打頻率(BCF)、平均移動(dòng)角度(MAD)。通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，引發(fā)學(xué)生深入思考，如精子的活力受哪些因素影響，精子的運(yùn)動(dòng)速度與精子形態(tài)有何關(guān)系，造成精子死亡因素有哪些。

帶著一大堆的疑問(wèn)學(xué)生們走進(jìn)了圖書館。他們孜孜不倦的查閱文獻(xiàn)資料，真正理解了細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)與功能的基本單位這個(gè)定義的內(nèi)涵［6］。構(gòu)成人體或其他高等動(dòng)物體的細(xì)胞種類繁多、形態(tài)各異，這些細(xì)胞的形態(tài)與其功能往往相適應(yīng)。善于運(yùn)動(dòng)的精子是由于它長(zhǎng)了一根長(zhǎng)長(zhǎng)的鞭毛［7］。Katz等［8］認(rèn)為精子頭部幾何形態(tài)異常是導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)異常的主要原因。由于研究手段不同，也有不同結(jié)果報(bào)道，認(rèn)為精子頭部畸形引起其流體力學(xué)特性改變導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性改變、尾部受損引起運(yùn)動(dòng)方式改變的可能性很小。一些外界因素共同作用于精子形態(tài)和動(dòng)態(tài)，引起兩者同時(shí)改變是導(dǎo)致精子形態(tài)和動(dòng)態(tài)異常相伴產(chǎn)生的主要原因［5］。

學(xué)生們?cè)诮處煹闹笇?dǎo)下繼續(xù)探索，對(duì)這些問(wèn)題有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí):精子DNA與體細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同。精子DNA損傷是造成精子畸形和運(yùn)動(dòng)速度、方向改變的根源。精子DNA損傷會(huì)影響受精、受精卵分裂和胚胎發(fā)育，最后導(dǎo)致不孕不育、流產(chǎn)死胎、胎兒、嬰兒發(fā)育異常。造成精子損傷的因素很多，如藥物、放射線、高溫、生殖道炎癥、環(huán)境毒素、高齡和生活方式［9］。有報(bào)道，吸煙者的精子DNA斷裂顯著增高，吸煙對(duì)精子核質(zhì)量是有害的。精子DNA損傷發(fā)生率與精子密度、活動(dòng)力、形態(tài)等參數(shù)有高度的負(fù)相關(guān)性。吸煙導(dǎo)致弱精子癥和畸精子癥，輕度吸煙對(duì)精子活力有影響，重度吸煙對(duì)精子形態(tài)有影響。吸煙男性的精子密度和形態(tài)低于不吸煙者，且吸煙對(duì)精子參數(shù)的影響有劑量依賴性［10］。長(zhǎng)期大量吸煙對(duì)精子凋亡有明顯影響［11］。原因是:香煙煙霧中的誘變物質(zhì)，不僅可以造成體細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷，還可以通過(guò)血-生殖腺屏障對(duì)生殖細(xì)胞或精子的發(fā)育造成影響。導(dǎo)致精子DNA斷裂增加，精子畸形增多［12］。慢性酒精中毒能使正常形態(tài)精子數(shù)下降。原因是:慢性酒精中毒引起維生素A和鋅的缺乏，進(jìn)而精子上皮細(xì)胞發(fā)育不良，導(dǎo)致少精子癥和無(wú)精子癥［13］。桑拿浴或經(jīng)常用溫度較高的水淋浴及在桑拿房停留的時(shí)間過(guò)久，可導(dǎo)致精子生成減少，或出現(xiàn)死精子［14］。因?yàn)樘接懙膬?nèi)容與日常生活密切相關(guān)，引發(fā)了學(xué)生的好奇心，調(diào)動(dòng)了學(xué)習(xí)的積極性。

1.3 白細(xì)胞檢測(cè)

檢測(cè)精液中白細(xì)胞是否存在，是尋找不孕不育癥病因手段之一。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)苯胺染色法:取精子細(xì)胞標(biāo)本1滴，加入1滴聯(lián)苯胺染液，混勻，于37℃放置20 min，鏡檢，白細(xì)胞染成褐色，其他細(xì)胞染成品紅色。采用聯(lián)苯胺染色方法，依據(jù)白細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，而使過(guò)氧化物酶陽(yáng)性白細(xì)胞染成棕色。在有過(guò)氧化氫存在時(shí)MPO分解H2O2，產(chǎn)生新生態(tài)氧，將聯(lián)苯胺氧化成帶酯式結(jié)構(gòu)的有色化合物。此方法涉及了生物化學(xué)中酶和底物特異性結(jié)合的理論知識(shí)與無(wú)機(jī)化學(xué)中的氧化還原反應(yīng)等知識(shí)點(diǎn)。

為什么有的樣本中存在白細(xì)胞?這對(duì)精子的形態(tài)、活力和活率有何影響，其發(fā)生機(jī)制如何?學(xué)生們經(jīng)過(guò)深入探討得知:因?yàn)橛醒装Y反應(yīng)，才使白細(xì)胞增多。精子中增多的白細(xì)胞可以刺激人類精子產(chǎn)生活性氧(Reactive Orygen Species，ROS)，這種刺激可以通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸或白細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性產(chǎn)物等多種途徑介導(dǎo)。25%～40%的不育男性精液中存在高水平的ROS［9］。當(dāng)過(guò)量ROS超過(guò)了抗氧化系統(tǒng)的清除能力和防御能力時(shí)，則導(dǎo)致精子DNA雙鏈斷裂，產(chǎn)生單鏈。且由于精子細(xì)胞膜中含有大量不飽和脂肪酸，因此理論上精子極易受到ROS的損害。精子DNA被破壞后，精子的形態(tài)、活力和活率也就發(fā)生了相應(yīng)的變化。

1.4 精子冷凍與復(fù)蘇

精子的細(xì)胞學(xué)分析實(shí)驗(yàn)，對(duì)標(biāo)本的活性要求很高。因此掌握精子的凍存與復(fù)蘇技術(shù)是非常必要的。

(1)冷凍。將精液與保護(hù)劑1∶1混勻后，裝入布袋，放在液氮液面上20 cm處冷凍20 min，再浸入液氮。

(2)復(fù)蘇。將凍存的標(biāo)本從液氮中取出后直接放入37℃水浴中5 min即可。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生親眼看到細(xì)胞經(jīng)超低溫冷凍后，仍能恢復(fù)原始狀態(tài)。

2 儀器設(shè)備及試劑

(1)儀器。自動(dòng)平衡離心機(jī)、液氮罐、恒溫水浴、恒溫培養(yǎng)箱、WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)。

(2)試劑。伊紅Y、聯(lián)苯胺、甲醇、玫瑰紅、雙氧水、瑞氏染液、吉姆薩染液、乙醇、甘油等。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由觀察精子的形態(tài)入手，進(jìn)而分析了精子的活力與活率，以及引起它們發(fā)生改變的各種外界因素。挖掘了男性不育癥的根源。通過(guò)對(duì)患者精子活力檢查、精子細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、白細(xì)胞的檢查;學(xué)生掌握了精子細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的檢測(cè)方法，熟悉了顯微鏡和離心機(jī)等簡(jiǎn)單設(shè)備的使用方法，了解了自動(dòng)化儀器的檢測(cè)方法。通過(guò)精子的冷凍與復(fù)蘇，掌握了細(xì)胞保存的原理和方法。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)始終堅(jiān)持基礎(chǔ)與臨床相結(jié)合的原則，使學(xué)生對(duì)探索醫(yī)學(xué)科學(xué)的奧秘產(chǎn)生了濃厚的興趣。增強(qiáng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性與自覺(jué)性，實(shí)驗(yàn)收到了良好的教學(xué)效果。

4 結(jié)語(yǔ)

精子細(xì)胞學(xué)分析這一創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)體系，通過(guò)五屆臨床醫(yī)學(xué)七年制和六屆臨床醫(yī)學(xué)五年制的教學(xué)實(shí)踐證明，其方法具有創(chuàng)新性、針對(duì)性、實(shí)用性和可行性。由于它來(lái)自臨床科研成果的轉(zhuǎn)化，與臨床檢驗(yàn)關(guān)系密切。因此能極大地調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，引發(fā)學(xué)習(xí)興趣。培養(yǎng)學(xué)生的科研意識(shí)和創(chuàng)新思維。提高學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)，分析問(wèn)題解決問(wèn)題的能力［15］。從而使學(xué)生站在科學(xué)領(lǐng)域的前沿來(lái)了解科學(xué)發(fā)展的動(dòng)態(tài)。以便盡快地適應(yīng)社會(huì)發(fā)展的需要。

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