許艷妮，李永臻，李霓，劉暢，馮婷婷，司書毅

·論著·

人膜轉運蛋白ABCA1及清道夫受體CLA-1表達上調劑的篩選和活性研究

許艷妮，李永臻，李霓，劉暢，馮婷婷，司書毅

目的篩選上調人 ATP 結合盒轉運體 A1（ABCA1）和人清道夫受體（CLA-1）表達的新型活性化合物，為抗動脈粥樣硬化藥物提供先導化合物。

ATP 結合匣式轉運子； 動脈粥樣硬化； 高通量篩選

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎性疾病，其特征是巨噬細胞和內皮細胞在血管壁聚積[1-2]，動脈血管壁逐步加厚并且硬化，最終引起動脈硬化斑塊的形成。盡管廣泛應用他汀類藥物，但是心血管疾病的發(fā)病率和死亡率仍然在上升[3]。降低低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）只能降低大約 1/3的心血管疾病風險，并且他汀類藥物的毒副作用現在廣受關注。目前迫切需要新的治療手段或新作用機制的藥物來治療動脈粥樣硬化，減少心血管疾病的發(fā)病風險，尤其是終生發(fā)病危險。

流行病學研究顯示，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）水平與冠狀動脈心臟?。╟oronary heart disease，CHD）的發(fā)生成負相關[4-5]。HDL-C 抗動脈粥樣硬化的一個重要機制就是促進膽固醇從外周組織（巨噬細胞）轉運到肝臟，這一過程也被稱為膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）[6-7]。介導膽固醇從巨噬細胞流出的主要受體包括 ATP 結合盒轉運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和清道夫受體 BI（scavenger receptor class B type I，SR-BI）等[8-10]。人的高密度脂蛋白受體被稱作CLA-1（CD36 and lysosomal integral membrane protein-II Analogous-1）[11]。研究表明，ABCA1 和（或）SR-BI/CLA-1 高表達能明顯增加膽固醇流出，降低動脈粥樣硬化的風險[12-13]。ABCA1 和SR-BI/CLA-1 被認為是預防或者治療動脈粥樣硬化的新靶標，增加其表達將有利于膽固醇流出，被認為是抗動脈粥樣硬化的有前景的方法[14-15]。因此，尋找能上調 ABCA1 和 SR-BI/CLA-1 的小分子化合物有可能成為一種有效的發(fā)現新型抗動脈粥樣硬化藥物的方法和手段。

本論文以 ABCA1 和 SR-BI/CLA-1 為靶點，利用前期工作中建立的人 ABCA1[16]和 CLA-1[17]表達上調劑篩選模型，對國家新藥（微生物）篩選實驗室化合物庫保存的樣品進行 20 000 樣次篩選，尋找到一系列結構新穎的抗動脈粥樣硬化先導化合物，為新型抗動脈粥樣硬化藥物的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑與培養(yǎng)基 RPMI 1640 培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；G418購自美國 Invitrogen 公司；熒光素酶檢測試劑盒購自美國 Promega 公司；篩選所用的化合物來自國家新藥（微生物）篩選實驗室，純度 > 95%。

1.1.2 細胞株 含有人 ABCA1 基因上游調控序列（-819 ～ +67 bp）的 ABCA1p-LUC HepG2 細胞培養(yǎng)于含 500 μg/ml G418 和 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中；含有人 CLA-1 基因上游調控序列（-1055 ～ -62 bp）的 CLA-1p-LUC HepG2細胞培養(yǎng)于含 600 μg/ml G418 和 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基中。兩支細胞株均為本實驗室構建并保存。

1.1.3 主要儀器 酶標儀為美國 PerkinElmer 公司的 EnVision 2104 型。

1.2 方法

1.2.1 化合物樣品高通量篩選 化合物樣品的高通量篩選方法參照文獻[18-19]。將 ABCA1p-LUC HepG2 或 CLA-1p-LUC HepG2 細胞以約 5 × 105個/ml 的密度接種于 96 孔板，每孔 100 μl。待細胞充分貼壁后，將培養(yǎng)基換為不含血清的RPMI 1640 或 MEM 培養(yǎng)基，每孔 200 μl。加入2 μl 待測的化合物樣品，終濃度為 10.0 μg/ml。18 ～24 h 后移去培養(yǎng)基，按照熒光素酶檢測試劑盒中所述方法測定細胞熒光素酶活性。計算待測樣品對熒光素酶活性的改變率，即加入待測樣品的熒光素酶活性與空白對照樣品（DMSO）的細胞熒光素酶活性的比值。以待測樣品的調節(jié)率 ≥ 150% 視為初篩陽性。

1.2.2 活性化合物在 ABCA1 和 CLA-1 上調劑模型上的 EC50測定 將篩選得到的活性化合物溶于 DMSO 中，制成 10 mg/ml 的母液。ABCA1p-LUC HepG2 和 CLA-1p-LUC HepG2 細胞鋪于96 孔板，方法同 1.2.1，同時設含終濃度 0.1% DMSO 的培養(yǎng)基孔做空白對照。細胞貼壁后，換為用無血清 RPMI 1640 或 MEM 稀釋的不同濃度化合物的培養(yǎng)基，每孔 200 μl。18 ～ 24 h 后，測定各孔細胞的熒光素酶活性，利用 Origin7.5 軟件計算 EC50。

表1 化合物在 ABCA1 和 CLA-1 模型中的活性Table 1 Induction of ABCA1 and CLA-1 transcription in HepG2 cells

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 高通量篩選結果

分別利用 ABCA1 和 CLA-1 上調劑模型對國家新藥（微生物）篩選實驗室化合物庫的 20 000余化合物進行高通量篩選。對相對熒光強度增加50% 以上的初篩陽性化合物進行復篩。根據測定結果，發(fā)現化合物 5033171 和 5242411 對 ABCA1 和 CLA-1 的上調活性大于 150%。通過對其結構類似物進行檢索得到化合物 7 個，分別測定化合物在 10.0 μg/ml 和 1.0 μg/ml 兩個濃度對 ABCA1 和 CLA-1 的上調活性，結果見表 1。

2.2 陽性化合物在 ABCA1 表達上調劑篩選模型中的量效關系

將 ABCA1p-LUC HepG2 細胞接種于 96 孔板，分別測定不同濃度的 5033171 和 5242411 在ABCA1 上調劑模型上的熒光素酶活性。通過分析樣品濃度與熒光素酶活性的改變率之間的關系，分別得到 5033171 和 5242411 在 ABCA1 表達上調劑篩選模型上的量效關系曲線（圖 1）。從圖 1可以看出，5033171 和 5242411 分別以劑量依賴性方式增加 ABCA1p-LUC HepG2 細胞熒光素酶活性，其 EC50值分別為 2.10 和 3.87 μmol/L，最高上調活性分別為 180% 和 177%。

2.3 陽性化合物在 CLA-1 表達上調劑篩選模型中的量效關系

將 CLA-1p-LUC HepG2 細胞接種于 96 孔板，分別測定不同濃度的 5033171 和 5242411 在CLA-1 上調劑模型上的熒光素酶活性。通過分析樣品濃度與熒光素酶活性的改變率之間的關系，分別得到 5033171 和 5242411 在 CLA-1 表達上調劑篩選模型上的量效關系曲線（圖 2）。從圖 2 可以看出，5033171 和 5242411 分別以劑量依賴性方式增加 CLA-1p-LUC HepG2 細胞熒光素酶活性，其 EC50值分別為 1.37 和 1.57 μmol/L，最高上調活性分別為 152% 和 162%。

圖1 5033171（A）和 5242411（B）在 ABCA1 表達上調劑篩選模型中的量效關系曲線Figure 1 Dose-response curves for 5033171 (A) and 5242411 (B) in log scale in ABCA1p-LUC HepG2 cells

圖2 5033171（A）和 5242411（B）在 CLA-1 表達上調劑篩選模型中的量效關系曲線Figure 2 Dose-response curves for 5033171 (A) and 5242411 (B) in log scale in CLA-1p-LUC HepG2 cells

3 討論

本研究利用已建立的 ABCA1 和 CLA-1 表達上調劑篩選模型篩選抗動脈粥樣硬化先導化合物。我們首次發(fā)現 N-(2-苯并噻唑基)- 3-(N-氰乙基磺酰胺基)苯甲酰胺類化合物具有不同程度地上調ABCA1 和 CLA-1 表達的功能。對結構類似的 7 個化合物進行初步構效關系分析發(fā)現，當苯并噻唑的6 位有長鏈烷基取代時（如 5242411 和 5033171），上調 ABCA1 和 CLA-1 活性明顯增加；利用生物電子等排變換得到的環(huán)庚烷并噻唑（如 5242311）和苯并咪唑母環(huán)上的無取代產物（如 5242231），沒有明顯上調 ABCA1 和 CLA-1 活性，苯并噻唑環(huán)上 6 位的烷氧基取代產物（如 5242221 和5242621）和其他位置的取代（如 5242421），沒有明顯上調 ABCA1 和 CLA-1 活性。從化合物結構和活性比較可以得出初步的構效關系：苯并噻唑片段及其類似物可能對保持活性非常關鍵，其環(huán)上特定位置取代基的變化對上調 ABCA1 和 CLA-1活性有利。初步構效關系的研究結果將對這類化合物的結構改造起到積極的指導作用。

ABCA1 和 SR-BI/CLA-1 在 RCT 中發(fā)揮重要作用。ABCA1 可介導細胞內磷脂和游離膽固醇轉運至貧脂或無脂的載脂蛋白 apoA-I[18]，SR-BI具有介導肝細胞選擇性攝取 HDL 膽固醇酯（CE）的功能[19]。N-(2-苯并噻唑基)- 3-(N-氰乙基磺酰胺基)苯甲酰胺類化合物（尤其是化合物 5033171 和5242411）能夠上調 ABCA1 和 CLA-1 表達，這將有利于泡沫化巨噬細胞內膽固醇的流出，減輕動脈粥樣硬化病變。

本研究為該類化合物抗動脈粥樣硬化及心血管疾病機制的深入研究提供了較好的分子探針。今后我們將對活性化合物繼續(xù)進行結構改造，進行深入的構效關系、分子藥理學及動物體內研究，以期獲得結構新穎、療效確切的新型抗動脈粥樣硬化藥物先導物。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(3):161-165

本期廣告目次

上海萬格科學器材有限公司………………… 封二

第六屆中國醫(yī)藥生物技術論壇…………… 前插頁1

蘭州民海生物工程有限公司……………… 前插頁2

北京晶鑫嘉德科技有限公司……………… 前插頁3

武漢三利生物技術有限公司……………… 前插頁4

北京源德生物醫(yī)學工程有限公司…………… 封三

廈門北大之路生物工程有限公司…………… 封四

Identification of up-regulators of ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) and scavenger receptor class B type I (CLA-1)

XU Yan-ni, LI Yong-zhen, LI Ni, LIU Chang, FENG Ting-ting, SI Shu-yi

ObjectiveThe aim of the study is to find new anti-atherosclerotic agents which can up-regulate human ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) and scavenger receptor class B type I (CLA-1) expressions.MethodsBy using cell-based high throughput screening models for ABCA1 and CLA-1 up-regulators, a series of novel analogs of substituted N-(benzo[d]thiazol-2-yl)benzamide containing 3-(N-(2-cyanoethyl)sulfamoyl) were found and assessed for their abilities to induce the transcription of the ABCA1 and CLA-1 genes. And the structure-activity relationship (SAR) around these analogs was also proposed.ResultsThe series of novel analogs of substituted N-(benzo[d]thiazol-2-yl)-3-(N-(2-cyanoethyl)sulfamoyl) benzamide could induce the transcription of the ABCA1 and CLA-1 gene. The EC50value of compounds (5033171 and 5242411) in ABCA1p-LUC HepG2 cell was 2.10 and 3.87 μmol/L, respectively. The EC50value of compounds (5033171 and 5242411) in CLA-1p-LUC HepG2 cell was 1.37 and 1.57 μmol/L, respectively. The preliminary SAR showed replacement the 6-substituent of benzo[d]thiazole with large alkyl led to increase of the activity among these compounds.ConclusionThis is a first report showing that N-(benzo[d]thiazol-2-yl)benzamide containing 3-(N-(2-cyanoethyl)sulfamoyl) is a promising backbone for designing ABCA1 and CLA-1 transcriptional up-regulators and could be viable leads for development of new drugs to prevent and treat atherosclerosis in the future.

ATP-binding cassette transporters; Atherosclerosis; High-throughput screening

SI Shu-yi, Email: sisyimb@hotmail

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.03.001

國家自然科學基金（81102443）；國家自然科學基金面上項目（81273515）

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室

司書毅，Email：sisyimb@hotmail.com

2012-12-17

方法應用本實驗室已經建立的 ABCA1 和 CLA-1 表達上調劑的高通量篩選模型對 20 000 個化合物進行篩選，從中獲得能上調 ABCA1 和 CLA-1 表達的化合物，對其及結構類似物進行活性測定，并進行初步的構效關系研究。結果化合物 5033171 和 5242411 具有較好的上調ABCA1 和 CLA-1 表達的活性，在 ABCA1 上調劑模型上的 EC50分別為 2.10 和 3.87 μmol/L，在 CLA-1 上調劑模型上的 EC50分別為 1.37 和 1.57 μmol/L。構效關系研究結果提示苯并噻唑的 6 位有長鏈烷基取代對增加活性有利。結論化合物 5033171 和 5242411 是活性很好的ABCA1 和 CLA-1 上調劑。

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2013, 8(3):161-165

Author Affiliation:National Center for Microbial Drug Screening, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China