王宇暉 童孟立 楊汝春

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究

王宇暉 童孟立 楊汝春

目的 探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是否能誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞株凋亡以及誘導(dǎo)凋亡的途徑。 方法 （1）體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞株；（2）應(yīng)用不同濃度（10-1～104ng/L）TGF-β1誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡；（3）103ng/L TGF-β1誘導(dǎo)不同時(shí)間（12、24、48h）后觀察足細(xì)胞凋亡情況；（4）采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V、Caspase 3；（5）實(shí)時(shí)定量PCR及Western印跡法檢測(cè)p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、Smad2、Smad3、Smad7mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。 結(jié)果 （1）小鼠足細(xì)胞在不同濃度（10-1～104ng/L）TGF-β1刺激下，細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組（均P＜0.05）；（2）隨著TGF-β1濃度增加、凋亡時(shí)間增加，足細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）；p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)增加；TGF-β1103ng/L為最佳誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡濃度，24h為最佳誘導(dǎo)凋亡時(shí)間；（3）與正常對(duì)照組比較，103ng/LTGF-β1誘導(dǎo)后Caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著增加（P＜0.01），p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)亦顯著增加（P＜0.01）。 結(jié)論 TGF-β1能誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡，呈濃度及時(shí)間依賴性。TGF-β1通過(guò)Smad通路、p38MAPK通路以及線粒體通路誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡。

TGF-β1足細(xì)胞 凋亡

足細(xì)胞是高度特異性的終末分化細(xì)胞，當(dāng)其出現(xiàn)損傷、凋亡進(jìn)而壞死、脫落、缺失，就會(huì)引起細(xì)胞數(shù)量減少和密度降低，導(dǎo)致腎小球進(jìn)行性硬化，最終導(dǎo)致腎功能喪失[1]。足細(xì)胞凋亡已被認(rèn)為是腎臟疾病發(fā)展的一種十分重要的機(jī)制，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）對(duì)足細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用十分重要[2]。TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，在腎小球硬化時(shí)表達(dá)增加。越來(lái)越多的研究表明足細(xì)胞在損傷時(shí)表達(dá)TGF-β1增加，而TGF-β1通過(guò)何種細(xì)胞傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用尚不明確。本研究旨在進(jìn)一步明確TGF-β1是否能誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡及其誘導(dǎo)通路。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)試劑：小鼠足細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，足細(xì)胞培養(yǎng)試劑（RPMI1640培養(yǎng)液、Ⅰ型膠原及0.25%胰蛋白酶）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)BS（10%）購(gòu)自杭州四季青公司，小鼠IFN-γ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，流式細(xì)胞儀試劑 Annexin V-FITC購(gòu)自?shī)W地利 Bender MedSystems公司，CaspGLOWTMCaspase 3購(gòu)自美國(guó)BioVision公司，實(shí)時(shí)定量PCR試劑Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，Reveraid Frist Strand cDNA Synthesis kit購(gòu)自加拿大Fermentas公司，引物合成由上海生工生物工程公司完成，Western-印跡法試劑盒及試劑（BCA蛋白分析試劑盒、NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑、ECL Western Blot）購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，小鼠抗大鼠p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1試劑購(gòu)自Peprotech公司。主要儀器：EPICS XL流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），熒光定量PCR儀（FTC3000型，加拿大Funglyn Biotech公司），RNA/DNA calculator（Pharmacia公司），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司），凝膠成像儀（美國(guó)Pharmacia Biotech公司）。

1.2 方法

1.2.1 足細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠腎小球足細(xì)胞株置于含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中預(yù)先經(jīng)0.1mg/ml膠原Ⅰ37℃處理1h，每瓶細(xì)胞加入10U/ml IFN-γ、100U/ml青鏈霉素，于33℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞于24h后完全貼壁，每2～3d傳代1次，至足夠?qū)嶒?yàn)所需數(shù)量。將傳代后足細(xì)胞株放入37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，14d后足細(xì)胞分化成熟，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 不同濃度：分別以0、10-1、100、101、102、103、104ng/L濃度TGF-β1刺激小鼠足細(xì)胞24h，其中0ng/L濃度TGF-β1為正常對(duì)照組。不同時(shí)間：選擇0、103ng/L作為刺激濃度，分別刺激12、24、48h，其中0ng/L濃度為正常對(duì)照組。另外，選擇103ng/L作為刺激濃度，刺激時(shí)間為24h，流式細(xì)胞儀測(cè)定小鼠足細(xì)胞Caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，Western印跡法檢測(cè)小鼠足細(xì)胞p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.2.3 Annexin V及Caspase 3檢測(cè) （1）Annexin V：收集各孔細(xì)胞上清液及細(xì)胞，洗滌后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105～5×105/ml；加入Annexin V-FITC后在常溫下孵育洗滌細(xì)胞，再加入碘化丙啶，在流式細(xì)胞儀上分析。（2）Caspase 3：調(diào)整細(xì)胞密度106/ml；加入1μl FITC-DEVD-FMK在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h；離心細(xì)胞洗滌，加入緩沖液再次懸浮細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀FL-1通道進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)，定量PCR檢測(cè)每個(gè)基因設(shè)3復(fù)孔，數(shù)據(jù)以3次實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用雙ΔCt的方法計(jì)算目的基因表達(dá)量，每個(gè)樣品目的基因表達(dá)量除以GAPDH表達(dá)量即為樣品基因相對(duì)含量。用Trizol提取細(xì)胞RNA；核酸分析儀測(cè)定RNA樣品濃度；1.5%瓊脂凝膠（agarose gel）2～4μl RNA上樣，電泳檢測(cè)RNA完整性；合成cDNA第一鏈；以25μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)：運(yùn)用Primer Premier 5結(jié)合Dnastar分析軟件及網(wǎng)上BLAST分析，設(shè)計(jì)并合成引物。引物序列：GAPDH上游序列為T(mén)GGCCTTCCGTGTTCCTAC，下游序列為GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA；p38MAPK上游序列為GGGACACCCCCTGCTTATCT，下游序列為T(mén)CCCTGCTTTCAAAGGACTGG；Smad2上游序列為AATACGGTAGATCAGTGGGACA，下游序列為CAGTTTTCGATTGCCTTGAGC；Smad3上游序列為T(mén)CTCCCCGAATCCGATGTCC，下游序列為 GCTGGTTCAGCTCGTAGTAGG；Smad7上游序列為GCATTCCTCGGAAGTCAAGAG，下游序列為CCAGGGGCCAGATAATTCGT。每個(gè)樣本均采用3復(fù)孔。PCR擴(kuò)增條件：95℃30s、95℃5s、60℃30～34s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè) 采用Western印跡法檢測(cè)。刮下細(xì)胞洗滌后，按100:1加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑（100ul+1μl），充分裂解后，離心取上清液。按BCA法測(cè)蛋白濃度。樣品與2×上樣緩沖液1∶1混合，煮沸5min，在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入小鼠抗大鼠p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7和內(nèi)參照GAPDH一抗（1∶200），一抗用封閉液稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，15min/次。將膜在1∶1 000稀釋的抗兔IgG-HRP中室溫孵育1h，TBST洗膜3次，將膜貼在ECL發(fā)光液上，曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，系統(tǒng)直接得出結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布及方差齊性，則用方差分析；非正態(tài)分布及方差齊性，則用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)后小鼠足細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，10-1～104ng/L TGF-β1誘導(dǎo)后小鼠足細(xì)胞凋亡率及壞死率均明顯高于正常對(duì)照組（均P＜0.05）；隨著TGF-β1誘導(dǎo)濃度的升高，細(xì)胞凋亡率及壞死率呈不同程度升高（均P＜0.05）。

2.2 不同濃度 TGF-β1誘導(dǎo)后 p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)量 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，小鼠足細(xì)胞在不同濃度TGF-β1刺激下，p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)量逐漸增加，至101ng/L時(shí)達(dá)到1.5倍，至103ng/L時(shí)達(dá)到2倍以上。

2.3 不同時(shí)間誘導(dǎo)后小鼠足細(xì)胞凋亡情況的比較 見(jiàn)表3。

表1 不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)后小鼠足細(xì)胞凋亡情況比較

表2 不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)后p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)量

表3 不同時(shí)間誘導(dǎo)后小鼠足細(xì)胞凋亡情況的比較

由表3可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，誘導(dǎo)12、24、48h后足細(xì)胞凋亡率及壞死率均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與誘導(dǎo)12h比較，誘導(dǎo)24、48h后足細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。誘導(dǎo)后48h細(xì)胞壞死率明顯高于誘導(dǎo)12、24h組（P＜0.01）。

2.4 不同時(shí)間誘導(dǎo)后p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)量 見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，誘導(dǎo)12h后，p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)不明顯，誘導(dǎo)24h后p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)量升高（達(dá)1.5倍），誘導(dǎo)48h后p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7mRNA表達(dá)明顯升高（達(dá)2倍）。

2.5 103ng/L TGF-β1誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞24h后Caspase 3及p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)量 誘導(dǎo)24h后Caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞比率為（62.93±5.88）%，顯著高于正常對(duì)照組的（4.73±1.38）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)情況見(jiàn)圖1、表5。

表4 不同時(shí)間誘導(dǎo)后p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)量

圖1 小鼠足細(xì)胞p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)電泳圖

表5 p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)量

由圖1和表5可見(jiàn)，TGF-β1組p38MAPK、Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

3 討論

足細(xì)胞屬于高度分化細(xì)胞，有獨(dú)特復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，參與腎小球毛細(xì)血管襻濾過(guò)屏障的構(gòu)成。在人類(lèi)及動(dòng)物模型的腎小球疾病如微小病變、局灶節(jié)段腎小球硬化、塌陷型腎病、膜性腎病、新月體腎病、糖尿病腎病和狼瘡腎炎等中，都發(fā)現(xiàn)有足細(xì)胞損傷。足細(xì)胞損傷包括：裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和成分的改變[3]、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)異常等[4]，嚴(yán)重的足細(xì)胞損傷則是細(xì)胞凋亡[5]或足細(xì)胞與腎小球基底膜（GBM）及其連接異常導(dǎo)致足細(xì)胞從基底膜脫落[6]。足細(xì)胞損傷及脫落在蛋白尿的發(fā)生以及腎小球硬化進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。研究表明，足細(xì)胞丟失20%就可以引起系膜擴(kuò)張、一過(guò)性輕度蛋白尿；足細(xì)胞丟失20%～40%可出現(xiàn)少量蛋白尿，球囊粘連和局灶節(jié)段腎小球硬化；足細(xì)胞丟失＞40%，球囊粘連顯著增加，腎小球硬化增多，持續(xù)大量蛋白尿，腎功能異常[7]。

多種應(yīng)答機(jī)制可以導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量的減少，包括凋亡、足細(xì)胞從GBM上脫落以及足細(xì)胞增殖能力的喪失[8]。足細(xì)胞凋亡已被認(rèn)為是腎臟疾病發(fā)展的一種十分重要的機(jī)制，其中TGF-β1對(duì)足細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用非常重要。TGF-β1在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)起調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、分化和凋亡的作用。Schiffer等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，2周齡的TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠，其足細(xì)胞凋亡率比野生型小鼠增加20倍。TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的通路如下：（1）Smad通路。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的足細(xì)胞中加入5.0ng/ml TGF-β1可迅速誘導(dǎo)Smad2/3磷酸化，15min即出現(xiàn)磷酸化，并持續(xù)8～24h，同時(shí)發(fā)現(xiàn)TGF-β1能強(qiáng)烈誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠和體外培養(yǎng)的足細(xì)胞內(nèi)Smad7蛋白表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的Smad7蛋白通過(guò)抑制抗凋亡的存活因子（NF-κB）/p65的活化，從而導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡[9]。（2）p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。MAPK也是足細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，nephrin可通過(guò)p38和JNK MAPK激活作為轉(zhuǎn)錄因子的激動(dòng)蛋白，而podocin可明顯加強(qiáng)nephrin的這一信號(hào)傳遞[10]，MAPK通路的活化與足細(xì)胞損傷、足突融合和蛋白尿的發(fā)生有關(guān)[11]。研究表明，葡萄糖可使足細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的TGF-β1，通過(guò)p38MAPK使足細(xì)胞凋亡增加、數(shù)量下降[12]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞在TGF-β1刺激20min～8h內(nèi)p38即持續(xù)磷酸化；2～12h時(shí)Bax表達(dá)增加，6h是Caspase 3開(kāi)始激活，24h后即出現(xiàn)了特異性的DNA片段，加入Caspase 3的抑制劑可以減少TGF-β1誘導(dǎo)的DNA片段產(chǎn)生[9]，表明TGF-β1可以通過(guò)激活Caspase來(lái)誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，此即凋亡的線粒體通路。

本研究結(jié)果顯示，隨著TGF-β1誘導(dǎo)劑量的增加，足細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，在103ng/L濃度時(shí)最明顯，至104ng/L濃度時(shí)足細(xì)胞凋亡數(shù)目并未增加，但壞死細(xì)胞數(shù)增多。因此本研究選擇103ng/L作為誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡最佳誘導(dǎo)濃度。小鼠足細(xì)胞在103ng/L TGF-β1刺激下，隨著TGF-β1刺激時(shí)間延長(zhǎng)，足細(xì)胞凋亡數(shù)目亦逐步增加，但刺激48h和24h之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且誘導(dǎo)48h后壞死細(xì)胞數(shù)目顯著增加。定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，隨著TGF-β1誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)小鼠足細(xì)胞Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)增加。同時(shí)，Western印跡法顯示，與正常組相比，TGF-β1組Smad2、Smad3、Smad7蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯增加，提示TGF-β1誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡是通過(guò)Smad通路完成的。隨著TGF-β1誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠足細(xì)胞p38MAPK mRNA表達(dá)亦增高，TGF-β1組p38MAPK蛋白質(zhì)表達(dá)增加，Caspase 3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯增多，提示TGF-β1亦激活了p38MAPK通路，通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡。TGF-β1能通過(guò)Smad通路、p38MAPK通路、線粒體通路等誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡，并呈濃度及時(shí)間依賴性，抑制TGF-β1表達(dá)或拮抗TGF-β1可能是防治足細(xì)胞凋亡的重要手段之一。

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TGF-β1induces apoptosis of mouse podocytes in vitro

WANG Yuhui,TONG Mengli,YANG Ruchun.
Department of Nephrology, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China

Objective To investigate the effect of TGF-β1on apoptosis of mouse podocytes and its signal pathway. Methods Cultured mouse podocytes were treated with different concentrations of TGF-β1(0,1x10－1～104ng/L)for 24 h,or treated with 103ng/L TGF-β1for different time duration(12,24,48h).Annexin V and Caspase 3 were measured by flow cytometry.The mRNAs and proteins of P38MAPK,Smad2,Smad3 and Smad7 were detected by real time PCR and Western blotting. Results Compared to controls(0ng/L TGF-β1)the ratio of apoptotic podocytes and mRNA expressions of p38MAPK,Smad2,Smad3 and Smad7 were increased in TGF-β1(10－1～104ng/L)treatment groups in a concentration and time-dependent manner(P＜0.05). Treatment with TGF-β1(103ng/L)for 24 h induced maximal apoptosis in podocytes.The ratio of Caspase3-positive podocytes was increased after treated with TGF-β1(103ng/L,24h)compared to controls(P＜0.01). Conclusion TGF-β1induces the apoptosis of mouse podocytes time-dependently and dose-dependently,in which Smad,p38MAPK signal pathway and mitochondrion might be involved.

TGF-β1Podocyte Apoptosis

2013-03-15）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

浙江省中醫(yī)藥管理局立項(xiàng)資助課題（2006C108）

310007 杭州市中醫(yī)院腎內(nèi)科