周 穎，張 輝，趙 敏，謝永紅

缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是氧調(diào)節(jié)亞基，又是功能亞基，在缺氧條件下HIF-1α具有促進(jìn)血管形成及影響腫瘤細(xì)胞增殖的功能[1]。環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種誘導(dǎo)型酶，與腫瘤細(xì)胞的增殖、抗細(xì)胞凋亡、腫瘤血管的生成有關(guān)[2]。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種DNA病毒，感染人和動(dòng)物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，越來越多的國內(nèi)外臨床和實(shí)驗(yàn)室研究檢測(cè)出肺癌患者攜帶HPV[3-4]，尤其是HPV 16、18型。但HPV感染與肺癌的關(guān)系，目前說法不一。有關(guān)肺癌中HIF-1α和COX-2與HPV感染的關(guān)系報(bào)道較少。本研究探討HIF-1α和COX-2在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生、發(fā)展中的作用以及HPV感染與NSCLC的相關(guān)性，并初步分析HIF-1α和COX-2與HPV感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集秦皇島市第一醫(yī)院2012年1—5月NSCLC新鮮癌組織標(biāo)本60例為NSCLC組，其中男46例，女14例；年齡36～80歲，平均55歲；鱗癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期26例，Ⅲ期6例；吸煙者43例，不吸煙者17例。另選取同期住院的肺良性病變組織20例為肺良性病變組，其中男13例，女7例；年齡28～80歲，平均42歲；肺結(jié)核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大皰4例，支氣管擴(kuò)張1例。標(biāo)本取材后，置-20 ℃保存，甲醛水溶液固定，石蠟包埋。

1.2 HPV聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)

1.2.1 引物 選用分別用來擴(kuò)增HPV 16、18型的特異性引物2對(duì)，均由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。引物序列見表1。

1.2.2 組織DNA的提取 取適量冷存組織，加提取緩沖液制成單細(xì)胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復(fù)抽提3次，再經(jīng)100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)緩沖液溶解，所得DNA在4 ℃保存。

表1 引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 每25 μl反應(yīng)體系中包含 10×buffer 2.5 μl，20 pmol/μl引物各0.5 μl，Taq酶1 μl(1 U/μl)，Mg2+1.5 μl，dNTPs 0.5 μl，去離子水16.5 μl及DNA模板2 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)特征為94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min。每次實(shí)驗(yàn)以不加模板為陰性對(duì)照，HPV 16、18型分別用Siha和Hela細(xì)胞株DNA作陽性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用加有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳約40 min，于紫外透射儀上觀察結(jié)果。

1.3 HIF-1α、COX-2免疫組化檢測(cè)

1.3.1 試劑與方法 HIF-1α抗體、COX-2抗體及通用型SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1∶100。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.3.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) HIF-1α陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，COX-2陽性表達(dá)為胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，顯色結(jié)果由兩位病理醫(yī)生采用半定量評(píng)分系統(tǒng)獨(dú)立判定。每例均在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果：0分陰性；1分陽性細(xì)胞百分率<25%；2分25%～75%；3分>75%。陽性強(qiáng)度：1分弱表達(dá)(淺黃色)；2分中等強(qiáng)度表達(dá)(棕黃色)；3分強(qiáng)表達(dá)(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強(qiáng)陽性(++)。就其結(jié)果進(jìn)行分析，將-、±合并為陰性，+、++合并為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、COX-2的檢測(cè)結(jié)果及兩者的相關(guān)性 NSCLC中HIF-1α的陽性表達(dá)位于細(xì)胞核(見圖1)，陽性率為48.3%(29/60)，肺良性病變組未見陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.163,P<0.05)。COX-2的陽性表達(dá)位于胞質(zhì)或胞膜(見圖2)，陽性率為58.3%(35/60)，肺良性病變組未見陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.741,P<0.05)。HIF-1α陽性組中COX-2的陽性率為82.8%(24/29)，高于HIF-1α陰性組的35.5%(11/31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.777,P<0.05)。HIF-1α與COX-2的表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.479，P<0.05)。

2.2 HPV DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果及與臨床病理特征的關(guān)系 HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%(25/60)，肺良性病變組為5.0%(1/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.193,P<0.05，見圖3)。HPV 16型12例，占48.0%(12/25)；HPV 18型13例，占52.0%(13/25)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.003,P=0.957)。NSCLC組HPV感染與性別、年齡、是否吸煙、組織學(xué)分型無關(guān)，而與分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05，見表2)。

2.3 HIF-1α、COX-2的表達(dá)與HPV感染的關(guān)系 HPV DNA陽性組與陰性組HIF-1α的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HPV DNA陽性組與陰性組COX-2的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表2 NSCLC患者HPV感染與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

Table2 Relationship between HPV infection and clinicopathological features of NSCLC

臨床病理特征例數(shù)HPVDNA陽性 陰性χ2值P值性別0.0110.918 男4619(41.3)27(58.7) 女146(42.9)8(57.1)年齡(歲)0.0230.880 <50156(40.0)9(60.0) ≥504519(42.2)26(57.8)吸煙0.0020.961 是4318(41.9)25(58.1) 否177(41.2)10(58.8)組織學(xué)分型0.0820.775 鱗癌4218(42.9)24(57.1) 腺癌187(38.9)11(61.1)分化程度6.8570.009 高分化121(8.3)11(91.7) 中、低分化4824(50.0)24(50.0)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8.2970.004 有3018(60.0)12(40.0) 無307(23.3)23(76.7)

表3 NSCLC患者HPV感染與HIF-1α、COX-2表達(dá)的關(guān)系

Table3 Relationship between HPV infection and HIF-1α,COX-2 expression in NSCLC

HPVDNA例數(shù)HIF-1α陽性 陽性率(%) χ2值 P值COX-2陽性 陽性率(%) χ2值 P值陽性組251352.00.2300.6311560.00.0490.825陰性組351645.72057.1

3 討論

HIF-1是由α、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞缺氧時(shí)，細(xì)胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進(jìn)腫瘤的血管形成和腫瘤的發(fā)展，而且可反饋性接受腫瘤生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)表達(dá)上調(diào)，如此形成惡性循環(huán)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5-6]。本研究中，HIF-1α在NSCLC中的陽性率為48.3%，肺良性病變組未見HIF-1α表達(dá)，提示HIF-1α在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[7]。

M：Marker；1、2：HPV 16陽性、陰性對(duì)照；3、4：HPV 16；5、6：HPV 18陽性、陰性對(duì)照；7、8：HPV 18

圖3 PCR檢測(cè)HPV 16、18型DNA擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

Figure3 Electrophoretogram of HPV type 16/18 DNA detected by PCR

COX-2是催化前列腺素合成的限速酶，在正常組織中基本不表達(dá)，但在許多病理生理環(huán)境下通過生長(zhǎng)因子、炎癥刺激、癌基因及腫瘤啟動(dòng)子等作用表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8]。COX-2在促進(jìn)腫瘤新生血管生成、刺激腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和機(jī)體的免疫反應(yīng)、參與前致癌物的活化、促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移方面起著重要作用[9]。HIF-1α和COX-2共同的靶基因?yàn)檠軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，兩者可能通過這一下游路徑促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和血管的形成。有研究表明COX-2可通過催化其產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)激活HIF-1α活性，通過COX-2/PGE2/HIF-1α/ VEGF途徑促進(jìn)腫瘤血管生成[10]。但也有研究認(rèn)為，COX-2也是HIF-1α的靶基因之一，受缺氧的誘導(dǎo)活化。兩者可能的聯(lián)系為缺氧誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，HIF-1α通過與COX-2啟動(dòng)子中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，激活COX-2的轉(zhuǎn)錄，而COX-2可以通過其代謝產(chǎn)物PGE2等反作用于HIF-1α，使HIF-1α活性增加，在核內(nèi)的積聚增加，翻譯轉(zhuǎn)錄加速，從而形成一個(gè)正反饋網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中HIF-1α和COX-2表達(dá)呈正相關(guān)，提示HIF-1α與COX-2的表達(dá)在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用。

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關(guān)系已經(jīng)引起人們的重視[11]。本研究結(jié)果顯示HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%，明顯高于肺良性病變組的5.0%，提示HPV感染與NSCLC相關(guān)聯(lián)，且隨著腫瘤分化程度的降低而增高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

HIF-1α與HPV感染之間的關(guān)系國內(nèi)外研究較少，其可能的聯(lián)系有：野生型P53蛋白可通過直接抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性和通過促進(jìn)mdm2介導(dǎo)的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解兩種形式抑制HIF-1α活性；而HPV 16、18型E6可以通過降解野生型P53蛋白[12]，從而促進(jìn)HIF-1α的積聚。但本研究未發(fā)現(xiàn)兩者有相關(guān)性。目前對(duì)COX-2與HPV感染之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)較少，有研究認(rèn)為，HPV感染致炎癥發(fā)生，產(chǎn)生大量炎性因子，激活COX-2，炎性細(xì)胞表達(dá)COX-2，再通過旁分泌機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起黏膜損傷，致使其易受HPV感染[13]。然而本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中COX-2表達(dá)與HPV感染無協(xié)同作用。

綜上所述，HIF-1α與 COX-2在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。采用藥物或應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制HIF-1α基因的表達(dá)以及針對(duì)COX-2的靶向治療將為NSCLC的預(yù)防和治療開辟新的途徑。

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