李 季，楊春華，賈露潔，梁 歡，郭麗娟，劉 羽，李攀峰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 雅安 625000)

多花黑麥草(Loliummultiflorum)是禾本科黑麥屬越年生牧草，其草質(zhì)優(yōu)良，柔嫩多汁，適口性好，是草食家畜的優(yōu)良飼料[1-2]。但其季節(jié)性較強(qiáng)，在生長旺盛的季節(jié)，南方地區(qū)多雨水天氣，不宜調(diào)制干草，所以青貯是保存南方牧草的最佳方法[3]。青貯是一種很好的飼料利用方式，可通過乳酸菌的增殖，將原料中的可溶性糖轉(zhuǎn)化為乳酸類物質(zhì)，創(chuàng)造酸性環(huán)境，抑制有害微生物的增殖，從而保存青貯飼料中的養(yǎng)分，達(dá)到飼料長期貯存的目的。但由于自然青貯效果較差，目前多向青貯原料中加入添加劑以促進(jìn)發(fā)酵，而乳酸菌添加劑又被認(rèn)為是其中的一種安全、無污染、低成本添加劑。綠汁發(fā)酵液作為一種天然的添加劑在一些試驗(yàn)中被驗(yàn)證其添加效果優(yōu)于市面上的乳酸菌添加劑，但其不易儲(chǔ)存，運(yùn)輸困難需現(xiàn)用現(xiàn)制，難以實(shí)現(xiàn)商品化[4]。因此，從綠汁發(fā)酵液中分離鑒定起主要作用的菌株便有較為重要的意義[5-7]。本研究以長江2號(hào)多花黑麥草為原料，分離、鑒定多花黑麥草綠汁發(fā)酵液中起主要作用的乳酸菌種類，觀察其作為添加劑對(duì)多花黑麥草青貯品質(zhì)的影響，并選育出優(yōu)良菌株，研發(fā)出相應(yīng)的乳酸菌添加劑并進(jìn)行推廣利用。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研園區(qū)的長江2號(hào)多花黑麥草。

1.1.2試劑 結(jié)晶紫染色液、碘液、復(fù)紅乙醇溶液、80%的無菌甘油、TE緩沖液、10%SDS、20 mg·mL-1蛋白酶K、10 mol·L-1CTAB、5 mol·L-1NaCl、酚/氯仿/異戊醇試劑、氯仿/異戊醇試劑、異丙醇、70%乙醇、滅菌去離子水和溴化乙錠。

1.1.3培養(yǎng)基 采用MRS固體、液體和半固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基不加瓊脂，半固體培養(yǎng)基瓊脂含量為4 g·L-1，固體培養(yǎng)基瓊脂含量為20 g·L-1，各種培養(yǎng)基在高壓滅菌前均調(diào)節(jié)pH至6.2～6.8。

1.1.4儀器設(shè)備 高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱、電子顯微鏡、粉碎機(jī)、紫外分光光度計(jì)、電子天平、恒溫水浴槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、梯度基因擴(kuò)增儀、電泳儀、酸度計(jì)和分光光度計(jì)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1綠汁發(fā)酵液的調(diào)制 將新鮮的多花黑麥草剪碎，加入2倍質(zhì)量的滅菌蒸餾水，用粉碎機(jī)粉碎1 min后用兩層紗布過濾，加入20 g·L-1的葡萄糖，分裝于100 mL的容量瓶中密封，放入30 ℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)48 h[8]。

1.2.2乳酸菌的分離純化及保存 在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)蘸取發(fā)酵好的綠汁發(fā)酵液，在配置好的MRS培養(yǎng)基上劃線，然后將培養(yǎng)基密封放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d[9]。同時(shí)采用試管斜面培養(yǎng)法和無菌甘油保存法保存菌種[10]。

1.2.3菌種的生理生化鑒定 菌種鑒定先采用生理生化鑒定的方法來初步確定分離菌株的名稱。生理生化鑒定根據(jù)凌代文和東秀珠[11]的方法，通過不同乳酸菌的顯色反應(yīng)來初步確定該種乳酸菌的名稱。

1.2.4乳酸菌產(chǎn)酸能力的測定 將鑒定出的菌株分別接種至pH值為6.2的MRS液體培養(yǎng)基，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，通過測定pH值來判斷乳酸菌的產(chǎn)酸能力[12]。

1.2.5乳酸菌的耐酸試驗(yàn) 將鑒定出的菌株分別接種至pH值為3.0的MRS液體培養(yǎng)基，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在660 nm下測定菌液的吸光值，判斷乳酸菌生長情況，從而推斷其耐酸能力[13]。

1.2.6乳酸菌的耐鹽試驗(yàn) 將鑒定出的菌株分別接種至NaCl濃度為5%、7%、8%、9%和10%的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～5 d后，測定乳酸菌的耐鹽能力[14]。

1.3菌種的分子鑒定 最后用分子手段對(duì)這幾種菌進(jìn)行最終鑒定。分子手段步驟為用DNA試劑盒提取該菌的DNA，在微量紫外分光光度計(jì)下檢測DNA純度，之后對(duì)乳酸菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，若觀察到約1 500 bp的條帶，則說明擴(kuò)增成功。擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物由生物科技公司測序。測得16S rDNA序列后，在NCBI上用BLAST程序比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得有關(guān)菌種的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，并用PHYLIP軟件包以Neighbor Join法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。若序列同源性大于97.5%，則可確定該種菌株[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的分離篩選結(jié)果 從試驗(yàn)材料多花黑麥草的綠汁發(fā)酵液中分離出菌株若干，從中挑選革蘭氏染色為陽性，形態(tài)整齊，有代表性的菌株若干(圖1)，進(jìn)行生理生化鑒定。

圖1 綠汁發(fā)酵液革蘭氏染色鏡檢Fig.1 Gram staining microscopic examination for Previously Fermented Juice of Italian ryegrass

2.2乳酸菌生理生化法鑒定結(jié)果 通過生理生化法，分離鑒定出10株不同乳酸菌。其中，乳酸桿菌兩株，分別編號(hào)為L-1、L-2；乳酸球菌8株，分別編號(hào)L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、L-8、L-9和L-10(表1)。

2.3乳酸菌產(chǎn)酸能力的測定 初步鑒定所得10株菌均能在48 h內(nèi)將pH值降為3.4以下，都具有良好的產(chǎn)酸能力，是良好的青貯菌種(表2)。

2.4乳酸菌的耐酸試驗(yàn) 通過乳酸菌耐酸試驗(yàn)，初步篩選所得10株菌在pH值為3.0的培養(yǎng)基上均能正常生長，OD660 nm值都大于1.0，可知其繁殖速度較快，有利于青貯時(shí)快速繁殖出大量乳酸菌，促進(jìn)發(fā)酵(表3)。

由于生理生化法無法十分準(zhǔn)確鑒定出乳酸菌的確切名稱，所以將上述10株菌送往生物科技公司進(jìn)行進(jìn)一步的分子手段鑒定，即16S rDNA序列同源性分析。

2.5乳酸菌的耐鹽試驗(yàn) 通過耐鹽性試驗(yàn)的測定，初步篩選出的10株菌在5%的NaCl環(huán)境下生長狀況良好；在7%的環(huán)境下生長較正常，特別是4 d時(shí)菌株生長較好；在8%的環(huán)境下部分菌株出現(xiàn)生長較弱的情況；在9%和10%的環(huán)境下10株菌株都不能生長。可知所有菌株均可耐受8%的鹽濃度(表4)。

表1 10株菌株的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)Table 1 Sugar fermentation test of 10 strains of lactic acid bacteria

表2 10株菌株的產(chǎn)酸能力測定Table 2 Acid production rate of 10 strains

表3 10株菌株的耐酸試驗(yàn)Table 3 Acid tolerance of 10 strains

表4 10株菌的耐鹽試驗(yàn)Table 4 Salt tolerance of 10 strains of lactic acid bacteria

2.6分子手段鑒定結(jié)果

2.6.1PCR擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)乳酸菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，均觀察到約1 500 bp的條帶(圖2)，說明擴(kuò)增成功。

2.6.2最終測序結(jié)果 測得16S rDNA序列后，在NCBI上用BLAST程序比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得有關(guān)種的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，最終確定6株菌種名稱(表4)。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The results of PCR amplifying

表5 6株菌的分子鑒定Table 5 Molecular identification of 6 strains of lactic acid bacteria

3 討論與結(jié)論

乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，其種類不同，作用的大小也有所不同。16S rDNA具有功能與進(jìn)化上的同源性，其序列進(jìn)化變異頻率緩慢，在結(jié)構(gòu)上極具保守性，且分子大小適中，攜帶著充足的生物信息。因此，16S rDNA序列分析法已成為一種鑒定微生種類的標(biāo)準(zhǔn)方法[14-16]。本研究運(yùn)用MRS培養(yǎng)基分離培養(yǎng)長江2號(hào)多花黑麥草綠汁發(fā)酵液中的乳酸菌，并采用傳統(tǒng)生理生化鑒定法初步鑒定出10株菌株，最終根據(jù)16S rDNA序列分析法確定10株菌株中有重復(fù)，實(shí)際鑒定菌株為6株。其中含1種乳酸桿菌：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，5種乳酸球菌：乳酸球菌(L.garvieae)、乳酸乳球菌(L.lactis)、魏氏菌(Weissellaconfusa)、魏氏菌(W.cibaria)和乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)。6株菌全為同型發(fā)酵乳酸菌，都具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸性、耐酸性和耐鹽性。在青貯中，需要添加能迅速降低pH值以達(dá)到抑制有害菌生長，長期保存飼料營養(yǎng)的菌株[17]，以上6種菌具備上述條件，可作為制作多花黑麥草青貯的良好添加劑，用以提高其青貯品質(zhì)，擁有較高的利用價(jià)值。但張濤等[18]通過不同發(fā)酵類型的乳酸菌制劑對(duì)青貯的品質(zhì)影響的研究表明，異型發(fā)酵乳酸菌對(duì)青貯的有氧穩(wěn)定性有明顯的提升作用，應(yīng)用時(shí)可混合添加。

劉晗璐[10]對(duì)牧草青貯品質(zhì)的研究表明，添加乳酸菌可以改善試驗(yàn)?zāi)敛萸噘A發(fā)酵品質(zhì)，其中球菌加桿菌組合處理組對(duì)牧草青貯品質(zhì)改善效果最優(yōu)，可將鑒定出的菌株按不同比例球菌加桿菌搭配組合添加至青貯中，研究其在實(shí)際青貯過程中對(duì)多花黑麥草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響。

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