王鳳林 何慧麗 李耀武 李瑾瑾 王春梅

【摘 要】 目的：分析暹羅鱷魚肉與魚肉、雞肉、豬肉中蛋白的差異，找出鱷魚肉特異蛋白。方法：采用電泳緩沖液勻漿鱷魚肉、魚肉、雞肉和豬肉，反復(fù)凍融5次后，得到4種動物肉勻漿液，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法，對4種動物肉進(jìn)行差異蛋白研究。結(jié)果：以13%的分離膠、60ug蛋白量上樣，大板（16cm*20cm）進(jìn)行SDS-PAGE，4種動物肉的電泳譜帶有明顯差異，鱷魚肉存在特征條帶。結(jié)論：鱷魚肉中差異蛋白較多，此方法可以用于鑒別鱷魚肉。

【關(guān)鍵詞】暹羅鱷魚肉；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳；特征譜帶

暹羅鱷（Siamese crocodile）隸屬爬行綱、鱷魚目、鱷科，具有繁殖能力強(qiáng)、生長快、抗病力強(qiáng)、皮質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，鱷魚肉含有豐富的優(yōu)良蛋白質(zhì)和人體必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、維他命及各種微量元素[1]。鱷魚肉不但味道鮮美，而且能補(bǔ)氣血、壯筋骨、治哮喘、滋心養(yǎng)肺，對慢性咳嗽、糖尿病也有顯著療效。另外，由于鱷魚肉含有高效抗體和奇特構(gòu)造的血紅蛋白，可以極快地提高人體免疫力和血液攝氧能力，改善機(jī)體缺氧癥狀[2-3]，因此，鱷魚肉很可能具有醫(yī)療保健作用。但是鱷魚肉是否含有不同于較廉價(jià)的常規(guī)食品肉類的特異的蛋白呢？如果作為保健品開發(fā)，如何進(jìn)行質(zhì)量控制呢？

本研究擬采用SDS-PAGE的方法，運(yùn)用凝膠定量軟件Quantity One，對鱷魚肉和其他3種動物肉中蛋白差異條帶進(jìn)行電泳分析，從而找到鱷魚肉與其他動物肉之間的差異特征條帶，以作為鱷魚肉及其他動物肉的鑒別依據(jù)，為鱷魚肉保健品的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 樣品來源 暹羅鱷魚肉由北京洪源澳達(dá)生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供，鯽魚肉、雞胸肉、豬肉采購自花家地南街菜市場。

1.2 儀器 BS323S電子天平（德國賽多利斯股份公司），移液器（Eppendorf公司），I-13型臺式高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）， UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)（上海龍尼柯儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市北方照明電器工程公司），PAC3000型穩(wěn)壓流電泳儀和165-2029型垂直板電泳槽（BIO-RAD公司），勻漿器。

1.3 試劑 牛血清白蛋白，甘氨酸，Tris，十二烷基磺酸鈉（SDS），N，N，N，N-四

甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（電泳級），甲叉雙丙烯酰胺，均由北京拜爾迪生物公司提供，甲醇，乙酸，磷酸等有機(jī)試劑（北京化學(xué)試劑公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 電泳樣品的制備方法[4] 將采得的4種新鮮動物肉切碎，置于勻漿器中，加入5倍體積的1×電泳緩沖液（0.025mol·L-1 Tris，0.2 mol·L-1甘氨酸，3.5 mmol·L-1SDS）勻漿5分鐘，再將4種勻漿液置于-80℃—常溫反復(fù)凍融5次，3000rpm離心5min，取上清，與上樣緩沖液混勻，沸水浴孵育3～5min，取出后冰浴，使蛋白質(zhì)變性，離心5min，制得電泳樣品。

2.2 樣品液濃度的測定 采用Bradford方法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，見參考文獻(xiàn)[5]。

2.3 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[6] 本實(shí)驗(yàn)采用5%濃縮膠[6]，電泳初始電壓為150V，染料進(jìn)入分離膠后，增加到200V，染料到達(dá)分離膠底部約1cm處，停止電泳，取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)R-250染色2h，脫色液（25%甲醇，7%乙酸）脫色至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。

2.4 電泳圖譜分析方法 采用凝膠定量軟件Quantity One。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與電泳圖分析結(jié)果

3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用13%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以等量60μg蛋白質(zhì)上樣，電泳圖譜較清晰，蛋白質(zhì)分離效果較好。4種動物肉的13%分離膠SDS-PAGE電泳圖譜見圖1

圖1 四種動物肉的13%分離膠SDS-PAGE電泳圖譜

Fig 1 SDS-PAGE （13% separating gel） of four animalsmeat

1-marker 2-鱷魚肉（crocodile meat） 3-魚肉（fish meat） 4-雞肉（chicken meat） 5- 豬肉（ guinea pig meat）

3.2電泳圖分析結(jié)果

電泳圖譜分析采用凝膠定量軟件Quantity One，使用該軟件得到4種動物肉勻漿樣品中主要蛋白質(zhì)的分子量和其含量百分比，以及主要譜帶的遷移率，按譜帶的泳動快慢將電泳圖譜分為A（Rf <0.35），B（0.350.65）3個(gè)區(qū)，并依各譜帶著色程度將譜帶分為三級[7]（見表1），色深而明顯的為一級譜帶，色淺但較明顯的為二級譜帶，色較淺仍可辨者為三級譜帶。

結(jié)果分析表明，4種動物肉的譜帶均有差異。鱷魚肉在A區(qū)具有3條遷移率（Rf）分別為0.059、0.163、0.313的一級譜帶，B區(qū)具1條Rf為0.425的一級譜帶，；C區(qū)具3條一級譜帶，Rf分別為0.672、0.727、0.985。

鱷魚肉的特征性譜帶為A3、A6、B3、C1、C4。這5條電泳條帶與其他3種動物肉相應(yīng)電泳條帶的對比見表2

由表2可以看出，鱷魚肉的A6、C1、C4條帶是其特有的，其余3種動物肉均沒有；鱷魚肉A3條帶含量比雞肉高；鱷魚肉的B3條帶含量比魚肉、雞肉高。因此，鱷魚肉的A3、A6、B3、C1、C4條帶可以用來鑒別鱷魚肉和其他動物肉。

由于鱷魚肉具有5條非常明顯的特征條帶，故易于區(qū)別。以上動物肉均經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果穩(wěn)定一致，可作為鱷魚肉與其他動物肉的鑒別依據(jù)。

4 討論

由電泳圖譜分析可知，暹羅鱷魚肉在 A 區(qū)、C區(qū)分別有 2 條特征條帶，在 B 區(qū)有 1 條特征條帶。從條帶的有無看，鱷魚肉和雞肉共有帶為 A3，但在表達(dá)量上有所差別； 鱷魚肉、魚肉和雞肉共有帶為 B3，但在表達(dá)量上有較大差異；A6、C1和C4 為鱷魚肉特有條帶，其余3種動物肉中均沒有，這5條帶均可作為鱷魚肉的特征鑒別帶。由于魚肉、雞肉、豬肉所含蛋白成分與鱷魚肉有所不同，臨床療效及保健功效也就有很大不同。本文通過用SDS-PAGE方法對4種動物肉進(jìn)行差異蛋白的分析，認(rèn)為可以用該方法作為鱷魚肉保健品質(zhì)量評價(jià)的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 許東暉，馬海萍，梅雪婷等. 鱷魚的活性物質(zhì)及其藥理作用、保健功效研究進(jìn)展[J]. 中國海洋藥物雜志，2007，26（6） ：44.

[2] 唐樑，秦明珠. 鱷魚的藥用研究和開發(fā)前景[J]. 中國醫(yī)藥指南，2007，5（11） ：346.

[3] 許東暉，羅肇璋，梅雪婷等. 鱷魚止咳膏鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)作用研究[J]. 中國中藥雜志，2007，32（10） ：961.

[4] 張貴君，李曉波，李仁偉等. T常用中藥生物鑒定. 北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2006. 67

[5] 楊桂蘭，郭學(xué)平.Lowry 法和 Bradford 法測定玻璃酸鈉中蛋白質(zhì)含量的比較.中國生化藥物雜志，2003，24（3） ： 131

[6] 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京： 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999. 382

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