牛田等

摘要：中國蘭花是觀賞植物，同時還有很高的文化價值和經濟價值。為此，從雜交育種、組織培養(yǎng)、誘變育種、太空育種、基因工程技術等方面綜合闡述了國蘭育種的研究進展。

關鍵詞：國蘭； 育種技術； 研究進展

中圖分類號：S682.31文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）07-0129-04

國蘭，屬于蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium ）植物，是狹義的蘭花，多年生草本花卉。國蘭是我國十大傳統名花之一，主要指春蘭（C. goeringii）、蕙蘭（C. faberi）、建蘭（C. ensifolium）、 墨蘭（C.sinense）和寒蘭（C. kanran）五大類。其味清幽，花色芬芳，具有很高的觀賞價值。本文綜述了國蘭不同途徑育種的研究進展，以期對國蘭育種和新品種選育提供理論基礎和技術依據。

1雜交育種

1.1種子萌發(fā)

國蘭種子萌發(fā)是國蘭雜交育種的關鍵步驟之一。大部分洋蘭（如大花蕙蘭、蝴蝶蘭等）雜交種子萌發(fā)容易， 出苗快。國蘭雜交育種進展緩慢， 其重要原因就是其雜交種子萌發(fā)難，雜種試管苗出苗率低。 目前 ，蘭花育種主要以傳統的人工雜交為主，我國蘭花雜交育種起步晚 ，品種改良緩慢 ，主要由于國蘭雜交育種方法繁殖系數低、速度慢、周期長，同時后代性狀容易分離，難以保持母本優(yōu)良性狀。目前，國蘭無菌萌發(fā)已經研究成功。張東旭等（2009）^[1]在蕙蘭雜交種子無菌萌發(fā)研究中發(fā)現110天的種子接種在KC培養(yǎng)基上萌發(fā)效果最佳。龐蕙仙等（2010）^[2]對春蘭、豆瓣蘭、蓮瓣蘭3種蘭屬植物進行種子萌發(fā)獲得了成功。

1.2遠源雜交

蘭科植物多為異花授粉，而且大多為昆蟲授粉。 但在引種馴化中， 野生蘭沒有特定昆蟲授粉， 難以結實， 需人工授粉。因此， 過去只能利用野生蘭自然變異進行選擇育種。不同雜交組合產生的中間繁殖體不同，如墨蘭和大花蕙蘭雜交，其雜交種萌發(fā)后形成原球莖，植株再生通過原球莖途徑進行，由于原球莖繁殖速度快，再生植株容易，產生試管苗易于成活，這為國蘭的遠緣雜交育種工作開辟了廣闊的前景^[3]。目前，一些研究人員已經取得了一定的成效。李方等（1998）^[4]獲得了蕙蘭與臺蘭 （ C.floribundum var.pumilum）的雜交組合。徐曉薇等（2011）^[5]利用寒蘭與春蘭、墨蘭雜交獲得成功。王豐妍等（2009）^[6]獲得了大花蕙蘭與春劍的雜交組合。

2組織培養(yǎng)

2.1中國蘭花組培程序和外植體

Morel（1960）^[7]利用植物組織培養(yǎng)技術將蘭花莖尖分生組織誘導形成原球莖并分化成植株，導致了蘭花栽培的變革，實現了蘭花生產的工廠化與商品化。國蘭離體培養(yǎng)程序的不同，往往是外植體來源的不同。中國蘭組織培養(yǎng)主要從兩方面進行，即通過種子及莖尖、側芽和花芽等外植體培養(yǎng)。如種子繁殖途徑，種胚分裂增殖形成原球莖或類原球莖，原球莖形成毛狀突起，其中一部分直接發(fā)育成芽，再形成不定根后形成完整植株，有的是原球莖形成毛狀突起后分裂延伸形成根狀莖，根狀莖頂端發(fā)育成芽。如莖尖、側芽和花芽繁殖途徑，從原球莖階段到幼苗的發(fā)育過程兩者相似^[8]，只是從種子萌發(fā)得到的根狀莖增殖速度比來自莖尖、側芽和花芽等外植體的根狀莖快。

蘭花種子在自然條件下萌發(fā)難 ，除了胚發(fā)育不完全，還與種皮通透性差或種皮中含有抑制物等有關^[9]。孫志棟等（2006）^[10]用春蘭的種莢成功誘導出原球莖。項艷等（2003）^[11]用墨蘭莖尖和芽成功誘導出類原球莖。楊宣華（2008）^[12]利用國蘭“金嘴”莖尖誘導產生原球莖。盡管莖尖和側芽是很好的外植體材料， 但有損于母體的生長， 且芽的數量有限。若采用花芽代替莖尖或側芽進行組織培養(yǎng)，可使母體免于受傷，此方法有待于進一步研究。

2.2培養(yǎng)基和植物生長調節(jié)物質

目前國蘭組織培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基比較多，如MS、 KC、VW、 RM、 H、 White 及其改良型。國蘭組織培養(yǎng)的不同階段對培養(yǎng)基要求不同，例如用于原球莖誘導增殖的培養(yǎng)基，常用的是改良的 MS、 White、VW、Kyoto等，而且B5，B11等培養(yǎng)基也在應用中^[13]。春蘭需要無機鹽含量較低的培養(yǎng)基，其長期繼代培養(yǎng)以1/2MS為宜^[14]，而蕙蘭、墨蘭則要求無機鹽含量較高的培養(yǎng)基^{[15，16 ]}。泰山林業(yè)科學研究院在對國蘭多年的研究中發(fā)現蕙蘭雜交種子接種在KC培養(yǎng)基上萌發(fā)效果最佳，原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為W培養(yǎng)基，而根狀莖分化和生根的基本培養(yǎng)基以MS為宜。

目前常使用的外源激素主要是生長素類物質 （ 如IAA、2， 4-D 和NAA） 和細胞分裂素類物質 （ 如6-BA、ZT和KT）。對不同的蘭花來說， 在不同的生長發(fā)育階段所需激素的量和種類都不盡相同。研究表明，2，4-D、KT、GA3+NAA 有助于蘭屬雜交種原球莖的生長， 2，4-D+GA3 有利于芽的生長， GA3+NAA有利于根的形成^[17]。 NAA 和KT 能促進蘭屬原球莖的生長^[18]。 KC+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L對原球莖的分化效果最好^[6]。NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L適合春蘭根狀莖的增殖，而IBA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L對春蘭根狀莖分化效果最好^[14]。

3誘變育種

3.1自然誘變育種

誘變育種是蘭花新品種選育的有效途徑。主要是使染色體加倍的方法培育出花朵碩大、花色芬芳、抗性強的蘭花新品種。同時，多倍體育種可以使蘭花植株粗壯、葉片寬厚，從而提高蘭花的整體觀賞價值。多倍體植物在自然界中是普遍存在的，在蘭花育種過程中可通過篩選、鑒定的方法獲得天然的多倍體植株。但是自然誘變的多倍體出現頻率很低，遠遠不能滿足國蘭遺傳育種工作的需要。

3.2物理方法誘變育種

利用物理方法使植物體染色體組加倍，其中包括低溫處理、高溫處理、輻射誘導等。例如馬麗婭等（2011）^[19]用 60Co-γ射線照射蝴蝶蘭盆栽苗，以探討蝴蝶蘭遺傳穩(wěn)定性。張永柏等（2009）^[20]用60Co-γ射線照射蝴蝶蘭花粉，選育出1個優(yōu)良變異株系。彭綠春等（2009）^[21]用60Co-γ射線不同劑量輻射四種蘭花組培苗，并觀察當代表型變異率。

3.3化學試劑誘變育種

利用秋水仙素誘導染色體加倍的方法是目前使用廣泛，同時也是誘導率最高的方法。李涵等（2005）^[22]使用秋水仙素誘導二倍體齒瓣石斛，成功獲得四倍體植株；張瑩等（2009）^[23]使用秋水仙素誘導二倍體石斛雜交品種Den. utopia ‘Messenger ×Den. whiterabbit ‘Sakurahime 獲得四倍體植株。楊麗娟等（2009）^{[ 24 ]}使用秋水仙素誘導二倍體大花蕙蘭品種 “紅寶石”獲得四倍體植株。但是有關國蘭的秋水仙素誘導尚未見報道。

3.4太空育種

太空育種主要是通過強輻射、微重力和高真空等誘發(fā)植物體基因突變，從而培育出新品種。太空育種具有高產、優(yōu)質、早熟、抗病力強等特點。在 2005 年廣州舉辦的第二屆中國盆栽花卉交易會上， 首次展出了經我國“神舟3號”飛船搭載的“太空蘭花” —— 石斛蘭（Dendrobium）， 該植株開花期提前了 3～4個月， 花枝數增加^[25]； 俄羅斯在“禮炮號”和“和平號” 空間站種植的蘭花， 繁殖快、成熟早^[26]?？梢姡?利用航天技術進行蘭花育種將產生類型更多、范圍更廣的變異類型， 對品種改良和種質資源拓展提供了新的途徑。

4基因工程育種

4.1基因克隆

田瑞雪等（2011）^[27]利用同源基因克隆方法，以墨蘭、春蘭為材料， 分別以cDNA第一鏈和基因組DNA為模板，用 RT-PCR和PCR方法克隆肌動蛋白基因（Actin）片段， 并進行序列和表達分析。崔波等（2009）^[28]以蝴蝶蘭的RNA為模板反轉錄合成cDNA，從中克隆ACC合成酶的基因片段，經測序后以反方向插入載體中， 構建了ACC合成酶反義基因的植物表達載體。向林等（2011）^[29]利用 RT-PCR結合 cDNA末端快速擴增 （RACE） 技術從春蘭中獲得了一個與花發(fā)育相關的GLO基因， 并對其進行了初步的表達分析。

4.2基因轉化

邵寒霜等（2000）^[30]構建一個適合在單子葉植物中高效表達的含有Lfy cDNA的表達載體（PBL-1），應用基因槍轉化法將其導入蘭花原球莖中，獲得了一些卡那霉素抗性克隆。張振華等（2011）^[31]用含有建蘭花葉病毒外殼蛋白基因CyMV-CP的pBI121為表達載體，以繼代培養(yǎng) 2～3 次的石斛類原球莖為轉化受體，用農桿菌介導法轉化石斛，建立并優(yōu)化了石斛的遺傳轉化體系。郝曜山等（2010）^[32]以蝴蝶蘭花梗腋芽誘導的類原球莖體為受體材料，利用農桿菌侵染并在侵染前后輔以超聲波及負壓處理的方法將gus基因導入蝴蝶蘭中，初步建立了蝴蝶蘭遺傳轉化體系。

5問題與展望

目前，蘭花正在向市場化、商業(yè)化、規(guī)模化生產的方向發(fā)展，蘭花育種也同樣面臨著新的挑戰(zhàn)。目前蘭花育種仍主要靠傳統的育種技術， 引種馴化不利于資源保護， 自然條件下突變體篩選， 變異頻率遠遠不能滿足需要， 人工誘變雖然提高了變異頻率， 但育種目標不確定， 盲目性較大。目前，以組培為手段開展中國蘭的多途徑綜合育種， 尤其是開展種屬間雜交， 并結合染色體加倍形成異源四倍體，從而培育出花色艷麗、株型大而緊湊、具有香味的優(yōu)良品種。隨著生物技術的飛速發(fā)展， 利用生物技術進行蘭花育種將成為新的育種途徑， 通過基因轉化， 有目的地轉入花色、花期、花型、抗性等單個基因， 使育種目標有定向性。隨著蘭花育種的不斷發(fā)展，我國必將培育出更多具有自主知識產權的蘭花新品種，從而使國蘭走向世界。

參考文獻：

[1]張東旭， 李承秀， 王長憲，等.蕙蘭雜交種子的無菌萌發(fā)和快速繁殖研究 [J].中國農學通報，2009，25（12）：159-164.

[2]龐惠仙， 楊紅明， 馬駿，等. 春蘭、豆瓣蘭、蓮瓣蘭和春劍 4種國蘭種子萌發(fā)特性研究初報[J].西部林業(yè)科學， 2010，3：60-64.

[3]張志勝，何瓊英，傅雪琳，等.中國蘭花遠緣雜交及雜交種子萌發(fā)的研究[J]. 華南農業(yè)大學學報，2001，22（2）：62-65.

[4]李方， 陳昆松，陳漢韜，等. 蕙蘭 × 臺蘭種間雜交種子無菌播種育苗技術研究[J].浙江農業(yè)大學學報，1998，24（1）：69-73.

[5]徐曉薇，柴明良，楊燕萍，等.寒蘭雜交及種子離體萌發(fā)研究[J]. 園藝學報，2011，38（10）：2010-2016.

[6]王豐妍，李承秀，王長憲，等.大花蕙蘭與春劍雜交原球莖增殖及分化研究[J].中國農學通報， 2009，25（23）：327-330.

[7] Morel G. Producing virus free Cymbidium[J]. Am. Orchid. Soc.Bull， 1960， 29： 495-497.

[8] 陳汝民， 葉慶生， 王小菁. 墨蘭種子胚的發(fā)育和培養(yǎng)初步研究[J].熱帶亞熱帶植物學報， 1995，3（4）：72-75.

[9]范成明，李枝林，何月秋，等.蘭花組織培養(yǎng)及分子生物學研究進展[J].園藝學報，2003，30（4）：487-491.

[10]孫志棟 ，陳惠云 ，葛紅，等.中國春蘭組織培養(yǎng)初探[J].安徽農學通報，2006，12（1）：20.

[11]項艷， 於鳳安，彭鎮(zhèn)華. 墨蘭離體快繁研究[J].林業(yè)科學研究，2003，16（4）：434-438.

[12]楊宣華. 國蘭——金嘴組培苗快速生根培養(yǎng)的研究[J].現代農業(yè)科學，2008，5（6）：18-19..

[13]賈勇炯，陳放，林宏輝，等. 建蘭簇生原球莖的誘導及分化諸因素研究[J].四川大學學報（自然科學版），1998，2：258-262.

[14]潘銀萍，李承秀，王長憲，等. 春荷鼎雜交根狀莖的組培快繁的研究[J]. 中國農學通報， 2010，26（5）：209-212.

[15]張菊野， 俞玲鳳， 連宏坤. 幾種影響春蘭原球莖生長與分化的因素[J]. 植物生理學通訊，1993，29（3）：175-178.

[16]陳麗， 潘瑞熾， 陳汝民. 墨蘭原球莖生長的研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 1999， 7（ 1） ： 59-64.

[17]Whimber D D. Clonal multiplication of Cymbidium through tissue culture of the shoot meristem[J]. Am. Orchid. Soc.Bul1，1963 ，32：105-107.

[18]Peak K Y， Chun C K. Effect of pH on the organogenesis and nutrient uptake through Cymbidium protocorms culture[J]. Korean. J. Plant Tiss. Cult.，1985，12（2）：1-7.

[19]馬麗婭，章鐵. 60Co-γ射線輻照對蝴蝶蘭遺傳穩(wěn)定性的影響[J]. 安徽農業(yè)大學學報， 2011， 38（5）： 802-805.

[20]張永柏，廖福琴，鐘淮欽，等. 蝴蝶蘭花粉輻射誘變育種初報[J]. 福建農業(yè)學報， 24（ 3） ：237-240. 2009.

[21]彭綠春，黃麗萍，余朝秀，等. 四種蘭花輻射育種研究初報[J].云南農業(yè)大學學報，2007，22（3）：332-336.

[22]李涵，鄭思鄉(xiāng)，龍春林. 齒瓣石斛多倍體的誘導初報[J]. 云南植物研究，2005 27（5）： 552-556.

[23]張瑩，王雁，李振堅. 秋水仙素誘導石斛多倍體的初步研究[J]. 核農學報，2009，23（3）：413-417.

[24]楊麗娟，高素萍，鄒宗蘭，等. 秋水仙素離體誘導大花蕙蘭多倍體試驗[J]. 北方園藝，2009，6：51-53.

[25]俞玟.太空蘭花下凡 引發(fā)商機一片[J].農村實用技術，2006，2：17.

[26]季孔庶.園林植物高新技術育種研究綜述和展望[J].分子植物育種，2004，2（2）：295-300.

[27]田瑞雪，張勝鵬，張建霞，等.國蘭肌動蛋白基因片段的克隆與表達分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2011， 19（1）：56-62.

[28]崔波，蔣素華，馬杰，等.蝴蝶蘭 ACC合成酶基因片段的克隆及其反義表達載體的構建[J].安徽農業(yè)科學，2009，37（34）：16781-16782，16785.

[29]向林， 李伯鈞， 秦德輝等.春蘭GLO基因的克隆和實時定量表達分析[J].浙江農業(yè)學報，2011，23（3）：517-522.

[30]邵寒霜，李繼紅，王勝培. lfy cDNA 高效單子葉植物表達載體的構建及轉化蘭花研究初報[J] .熱帶作物學報，2000，21（3）：58 -62.

[31]張振華，王濤，陳喜蓉，等.農桿菌介導的CyMV-CP基因對石斛遺傳轉化研究[J].熱帶作物學報，2011，32（3）：463-467.

[32]郝曜山，杜建中，孫毅. 農桿菌介導轉化蝴蝶蘭遺傳體系的研究[J].山西農業(yè)大學學報（自然科學版）， 2010，30（3）：205-208.