張穎 孫海生等

摘 要： 【目的】葡萄白腐病是引起葡萄減產(chǎn)的重要病害，葡萄白腐病不但在我國流行嚴(yán)重，在世界上主要葡萄產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，由于白腐病菌難以防治，挖掘抗病種質(zhì)有利于抗病機制研究及抗病育種的開展?！痉椒ā垦芯坷檬覂?nèi)離體菌絲接種的方法，對收集到的中國野生葡萄種質(zhì)17個種、亞種及種間雜種的35個株系進(jìn)行葡萄抗白腐病鑒定?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，中國野生葡萄不同種之間對白腐病的抗性存在差異，其中都安毛葡萄、塘尾葡萄實生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞鋼廟街桑葉、蘡薁武漢A1、靈寶變?nèi)~、燕山葡萄0947為抗病株系，刺葡萄♂為最抗病的株系，是研究抗白腐病機理的理想材料?！窘Y(jié)論】在中國野生葡萄中存在葡萄白腐病的抗性植株。

關(guān)鍵詞：中國野生葡萄； 抗?。?葡萄白腐?。?離體接種

中圖分類號：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0191-06

葡萄是我國栽培最廣泛的水果之一，2010年，我國葡萄栽培面積為55.2萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)843萬t，為世界第2位和第1位（來源于FAO，2010年），并且還在逐年增加，與葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展伴隨的是葡萄病害的發(fā)生和危害，白腐病是嚴(yán)重危害葡萄生產(chǎn)的四大病害之一，對葡萄的危害包括降低樹勢、損毀枝蔓、降低產(chǎn)量甚至引起絕收，嚴(yán)重威脅葡萄生產(chǎn)，如何提高葡萄對白腐病的抗性是亟待解決的問題。葡萄白腐病又稱腐爛病，致病菌為Coniothyrium diplodiella（Speq.）Sacc，屬于殼小圓孢屬，為葡萄專性寄生，不僅危害果粒還危害枝條和葉片，是葡萄生長期引起果實腐爛、導(dǎo)致減產(chǎn)的主要病害。

我國葡萄的主要栽培品種是歐亞種，但是歐亞種對白腐病都缺乏抗性，起源于中國葡萄屬植物種類多、遺傳資源豐富，已知的葡萄野生種約38個種，種類約占世界的60%，并且新種還時有發(fā)現(xiàn)[1]，在這些野生種中蘊含大量的抗性資源[2]，在前人的研究中刺葡萄、山葡萄和華東葡萄中都有抗病的株系[3]，但是受資源收集數(shù)量的限制，缺乏對中國野生葡萄資源的全面系統(tǒng)的評價。挖掘真正的抗病種質(zhì)，研究中國野生資源的抗性機理對改良現(xiàn)有栽培品種的抗性、培育抗性新種質(zhì)有重要的實踐和理論意義?？共⌒匀斯そ臃N鑒定法可以避免田間環(huán)境條件和病原種類、數(shù)量的差異。因此，在相同條件下，采用統(tǒng)一的評價方法和評價指標(biāo)對大量種質(zhì)資進(jìn)行抗病性的系統(tǒng)評價具有十分迫切的需求。由于利用病菌孢子接種及室外接種的鑒定方法極易受到外界環(huán)境的影響，如濕度、溫度的變化會影響病原孢子的萌發(fā)率，從而影響實驗結(jié)果，獲得可靠的結(jié)果需要幾年的連續(xù)調(diào)查。本研究借鑒前人的鑒定方法[4]，研究者采用室內(nèi)離體鑒定的方法，避免外界條件的影響；同時采用菌絲體接種，避免因孢子萌發(fā)不整齊的誤差，制造傷口打破葉片結(jié)構(gòu)性引起的抗性反應(yīng)，以期快速準(zhǔn)確鑒定中國葡萄野生種質(zhì)中的抗病株系，并為其抗病機理的研究提供材料及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料均采自鄭州果樹研究所國家種質(zhì)（葡萄）資源圃，編號為資源圃編號

1.2 病菌培養(yǎng)

葡萄白腐病病原菌來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。葡萄白腐病病菌為葡萄專性寄生，可以離體培養(yǎng)，將病菌接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下黑暗培養(yǎng)，3 d后菌絲均勻分布，但未產(chǎn)生孢子，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 接種及保濕方法

取枝條上中部成熟葉片（葉齡10～15 d），每個處理取6枚葉片，將菌餅和無菌PDA塊（CK）分別接種葉片的正面，刺傷時避開葉片主脈，每個葉片接種1～4處，分布于葉片的不同位置，同時設(shè)6個重復(fù)，將接種后的葉片放入大培養(yǎng)皿的下底內(nèi)，上蓋覆浸濕但不滴水的濾紙，不能接觸葉片，封口膜密封保濕，28 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.4 傷口處理方法

以‘康可和‘紅地球為試材，采用無傷、接種1針刺傷、5針刺傷（均勻分布在菌餅下直徑2 mm的圓形區(qū)域內(nèi)，下同）等3種傷口處理方式，試驗重復(fù)3次，連續(xù)觀察。

1.5 葉片正反面接種處理

以‘康可和‘紅地球為試材，分別設(shè)正、反面接種處理，利用1.2和1.3中的方法進(jìn)行處理。

1.6 處理時間

以‘康可和‘紅地球為試材，接種后利用1.2和1.3中的方法進(jìn)行處理，并在接種60 h后統(tǒng)計。該試驗重復(fù)2次，連續(xù)2 a統(tǒng)計結(jié)果。

1.7 種質(zhì)鑒定

綜合分析1.2、1.3、1.4處理的結(jié)果，選擇最佳處理條件，對已經(jīng)收集到的中國野生葡萄資源的不同種及株系，進(jìn)行白腐病抗性鑒定及抗性種質(zhì)篩選。以美洲種的‘康可和歐亞種的‘紅地球為參照。

1.8 結(jié)果統(tǒng)計及分析方法

采用十字交叉法測量病斑直徑，處理間的差異顯著性分析用Duncans Multiple Range Test進(jìn)行，以常見的‘紅地球和‘康可為分級參照，抗性分級如下：Ⅰ>‘康可；‘康可<Ⅱ>‘紅地球；Ⅲ<‘紅地球，篩選抗性種質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄種質(zhì)資源鑒定刺傷條件

為了確定葉片發(fā)病程度與傷口之間關(guān)系，以‘康可和‘紅地球為試材，采用未針刺、1針刺和5針刺3種處理方式，48、60、72、84 h連續(xù)統(tǒng)計病斑大小，采用十字交叉法測量病斑直徑，處理間的差異顯著性分析用Duncans Multiple Range Test進(jìn)行。結(jié)果顯示，在以‘康可為試材的試驗中，病斑大小在有傷口與沒有傷口的處理中差異顯著，但是在傷口大小的處理中差異不顯著；在以‘紅地球為試材的試驗中，病斑大小在傷口有無與傷口大小差異均不顯著?；谝陨辖Y(jié)果以下試驗均采用1針刺的處理方法。

2.2 葡萄種質(zhì)資源鑒定的接種位置

以‘康可和‘紅地球為試材，采用1針刺的處理方法，分別在葉片正面和背面接種，接種60 h后，統(tǒng)計病斑，分析差異。結(jié)果表明，‘康可和‘紅地球葉片正面和背面接種后，病斑大小差異不顯著基于操作方便的考慮，在鑒定種質(zhì)抗性的試驗中采用葉片正面接菌。

2.3 葡萄種質(zhì)資源鑒定

在室內(nèi)環(huán)境條件一致的情況下，以美洲種的‘康可和歐亞種的‘紅地球為對照種質(zhì)，對中國野生種的17個種的35個株系進(jìn)行了白腐病的抗性鑒定，結(jié)果顯示其抗病性由大到小分別為：刺葡萄♂、舞鋼廟街葡萄桑葉、燕山葡萄、刺葡萄♀、武漢A1、塘尾實生、都安毛葡萄、靈寶變?nèi)~、‘康可、菱葉葡萄0945、華東1057、紅巖華東01、青要山秋葡萄、美麗葡萄1104、湖南云南葡萄、寶天曼網(wǎng)脈葡萄、葛蕌♀、葛蕌♂、湖南刺葡萄、嵩山樺葉、云南葡萄、樺葉、廣西毛葡萄、四道嶺變?nèi)~、靈寶秋葡萄、雙溪腺枝01、雙溪腺枝03、‘紅地球、桑葉943、高山2號、華佳八號、多裂葉蘡薁、桑葉1099、桑葉946、華東1058、九里溝桑葉、青要山蘡薁（圖5）。

為了使鑒定結(jié)果有一個比較直觀的表現(xiàn)，以‘康可和‘紅地球參照種質(zhì)進(jìn)行抗性分級，共分為三級，Ⅰ級抗性高于‘康可，Ⅱ級抗性處于‘康可和‘紅地球之間，Ⅲ級抗性低于‘紅地球。Ⅰ級抗性有：都安毛葡萄、塘尾葡萄實生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞鋼廟街桑葉、蘡薁武漢A1、靈寶變?nèi)~、燕山葡萄0947；Ⅱ級抗性的有：菱葉葡萄0945、華東1057、紅巖華東01、青要山秋葡萄、美麗葡萄1104、湖南云南葡萄、寶天曼網(wǎng)脈葡萄、葛蕌♀、葛蕌♂、湖南刺葡萄、嵩山樺葉、云南葡萄、樺葉、廣西毛葡萄、四道嶺變?nèi)~、靈寶秋葡萄、雙溪腺枝01、雙溪腺枝03；Ⅲ級抗性的有：桑葉943、高山2號、華佳八號、多裂葉蘡薁、桑葉1099、桑葉946、華東1058、九里溝桑葉、青要山蘡薁（表2）。結(jié)果表明，中國野生葡萄不同種之間對白腐病的抗性存在差異，刺葡萄最為抗病，腺枝葡萄最不抗??；毛葡萄、桑葉葡萄、蘡薁葡萄、變?nèi)~葡萄中存在抗病株系，其中刺葡萄♂最為抗病。

3 討 論

在田間自然條件下，來源于歐亞種的葡萄種質(zhì)都不同程度地感染白腐病，而中國野生種質(zhì)未見感病[5-7]，本試驗中人工針刺接種時，野生種質(zhì)會有不同程度的感病，有的野生種甚至超過了歐亞種，如多裂葉蘡薁、桑葉1099、桑葉葡萄946、華東葡萄1058、九里溝桑葉、青要山蘡薁等。分析存在差異主要有兩方面的因素，其一，本試驗中采用的是菌絲接種的方法，菌絲可以直接侵染，排除了葡萄白腐病病菌孢子不萌發(fā)造成的誤差；其二本試驗中接菌時制造了傷口，破壞了葉片的表面結(jié)構(gòu)，排除了葡萄葉片因表面結(jié)構(gòu)造成的抗性，因此抗性反應(yīng)來源于植物內(nèi)在機制的作用，是植物本身通過內(nèi)在免疫反應(yīng)的表現(xiàn)。

王躍進(jìn)等[5]研究結(jié)果表明刺葡萄的果實表皮細(xì)胞層和角質(zhì)層比歐洲葡萄品種佳利釀厚的多，而且表皮細(xì)胞排列也緊密，有利于保護(hù)野生種葡萄免受白腐病病菌侵染。姜建福等[8]對中國野生葡萄葉片顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄中毛葡萄、桑葉葡萄的葉片總厚度和葉片各組織厚度較小，樺葉葡萄在東亞種群中葉片總厚度和葉片各組織厚度最大，本研究中的抗性結(jié)果與其并無一定的相關(guān)性，并且從葉片結(jié)構(gòu)的角度難以解釋種內(nèi)不同株系的抗性差異。以菌絲為病原菌的侵染方式不同于自然界中病原菌的侵染方式，但是更能表現(xiàn)不同種質(zhì)內(nèi)在的免疫反應(yīng)。

在生理生化水平上，中國野生抗性種質(zhì)中的確存在內(nèi)在的抗性機理，王躍進(jìn)等[5]在研究中認(rèn)為生物體內(nèi)生化物質(zhì)對病原菌有能動反應(yīng)，他推測是植物體內(nèi)的丹寧，游離有機酸和多酚氧化酶的高含量或高活性對病菌的擴展起到了抑制作用。賀普超等[2]研究葡萄葉片和果實對白腐病的抗性與可溶性糖、游離有機酸和過氧化物酶活性有密切關(guān)系。

分子生物學(xué)研究表明，植物在受到病原菌入侵時，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組會發(fā)生很大的變化，轉(zhuǎn)錄因子被激活，進(jìn)而調(diào)控下游抗性基因的表達(dá)，從而達(dá)到抗病目的。重要的轉(zhuǎn)錄因子包括WRKY、MYB、ERF、NAC 等轉(zhuǎn)錄因子家族。作為葡萄白腐病抗性極強的種質(zhì)，進(jìn)一步從生理生化和分子生物學(xué)水平研究刺葡萄♂的抗性機理將為葡萄的抗性育種提供理論及實踐方面的依據(jù)。

4 結(jié) 論

中國野生葡萄不同種之間對白腐病的抗性存在差異，其中都安毛葡萄、塘尾葡萄實生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞鋼廟街桑葉、蘡薁武漢A1、靈寶變?nèi)~、燕山葡萄0947為抗病株系，刺葡萄♂為最抗病的株系，是研究抗白腐病機理的理想材料。

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