胡國君　董雅鳳

摘 要： 葡萄是我國的一種重要果樹，在長期的無性繁殖過程中受扇葉病、卷葉病、皺木復合病和斑點病等多種病毒病的危害，給葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來了嚴重的影響。在生產(chǎn)上，無病毒的繁殖材料是控制病毒病的主要途徑。總結了莖尖培養(yǎng)、熱處理、化學處理、體細胞胚再生、電療法和超低溫脫毒等方法的脫病毒原理及在葡萄病毒脫除中的應用效果，分析了不同方法所適合脫除的病毒種類。通過對上述研究進展的綜述，以期為我國葡萄病毒脫除技術研究提供參考信息。

關鍵詞： 葡萄； 病毒； 脫除

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0304-07

葡萄（Vitis spp.）作為一種重要果樹，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，但由于長期的無性繁殖，容易感染多種病毒病害。據(jù)報道，侵染葡萄的病毒種類有60種[1]，其中，分布最廣、危害最重的葡萄病毒病害主要有扇葉病、卷葉病、皺木復合病和斑點病。研究表明，至少有10種病毒與葡萄卷葉病的產(chǎn)生有關，葡萄感染卷葉病毒后一般減產(chǎn)20% 左右[1-2]。皺木復合病是葡萄的一種重要的通過嫁接傳染的病毒病害，其病原還不是很明確，已有研究表明，葡萄病毒A（Grapevine virus A， GVA）、葡萄病毒B（Grapevine virus B， GVB）和沙地葡萄莖痘病毒（Grapevine rupestris stem pitting- associated virus， GRSPaV）與該病害的產(chǎn)生有關[3-4]。該病害在葡萄指示植物上產(chǎn)生四種癥狀：Kober莖溝病，LN33莖溝病，栓皮病和沙地葡萄莖痘病[5]。據(jù)報道，葡萄感染皺木復合病后產(chǎn)量可減少14%～70%，嫁接成活率降低40%，生長量減少30%[6]。由于葡萄繁殖主要靠扦插和嫁接，使得病毒長期積累和重復感染，并表現(xiàn)為復合侵染和潛伏侵染的特征，即使是同種病毒，由于侵染的品種和發(fā)病時期不同也表現(xiàn)各異，因而給病毒的識別和診斷帶來極大的困難。此外，病毒的侵染源復雜，傳播途徑廣泛也進一步加大了防治的困難[7]。目前控制病毒病的主要途徑就是栽培無病毒的繁殖材料，建立無病毒母本園，因此，高效的病毒脫除技術是促進葡萄無病毒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎。綜述了莖尖培養(yǎng)、熱處理、化學處理、體細胞胚再生、電療法和超低溫脫毒等方法在葡萄病毒脫除中的應用，分析這些方法對不同葡萄品種及病毒種類的脫除效果，并揭示各個方法的病毒脫除機理，以供參考。

1 莖尖培養(yǎng)脫毒

很早以前人們就發(fā)現(xiàn)病毒粒子在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，感病植株的莖尖和根尖內(nèi)不含病毒或含量很低[8-9]，研究表明在莖尖處存在一個無毒區(qū)，直徑約為0.1 mm，長約為0.25 mm，此外，愈傷組織中也存在大量的健康細胞[10]，因此莖尖和愈傷組織成為獲得無病毒植株的主要材料。目前關于莖尖組織不含病毒的原因有很多種觀點[11]：（1）頂端分生組織分化速度快，不含維管束，病毒很難到達；（2）莖尖生長點細胞代謝比較旺盛，病毒合成受到限制；（3）莖尖處存在一個“病毒失活系統(tǒng)”；（4）莖尖內(nèi)生長素濃度很高，可通過干擾核酸的代謝來抑制病毒的復制。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)莖尖無毒區(qū)的存在可能是由于病毒RNA在具有分生能力的莖尖細胞中被靶向降解，即發(fā)生了RNA沉默[12]。

早在1960s莖尖培養(yǎng)就被用于葡萄病毒的脫除[13]。莖尖無毒區(qū)范圍很小，操作較為困難，而植株的再生能力與莖尖的大小成正比，病毒的脫除率與莖尖的大小成反比，研究表明，切取的葡萄莖尖小于0.3 mm，很難獲得再生植株；而莖尖大于0.4 mm，病毒則較難脫除，所以采用莖尖培養(yǎng)的方法進行葡萄病毒脫除時，切取的莖尖大小一般為0.2～0.5 mm[2，14-15]。Habili等[16]利用莖尖培養(yǎng)的方法從24種進口的葡萄品種中脫除了多種病毒或類似病毒引起的病害，通過指示植物和dsRNA檢測發(fā)現(xiàn)該方法脫除葡萄卷葉病的效率可達100%，同時發(fā)現(xiàn)該方法對莖痘、黃斑等其他癥狀的產(chǎn)生也表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。不同部位莖尖的病毒脫除效果是不同的，Valero等[17]研究發(fā)現(xiàn)頂芽中葡萄卷葉伴隨病毒-3（Grapevine leafroll-associated virus-3， GLRaV-3）的脫除率可達91%～100%，而前3個側芽的脫除率僅為71%～87%。此外，莖尖培養(yǎng)的脫除率還與外植體采集時間有關，夏季材料的脫除率最高。韌皮部限制性病毒不能入侵莖尖等分生組織，所以莖尖培養(yǎng)的方法對這類病毒的脫除效果較好，而對于其他種類的病毒，脫除率根據(jù)葡萄的種類和病毒的分布情況而定。Gribaudo等[18]采用莖尖培養(yǎng)的方法處理16個葡萄品種的26份樣品，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)GRSPaV的脫除率僅為28.9%。莖尖培養(yǎng)的方法還被用于葡萄類病毒和細菌病害的脫毒研究中[19-20]。

2 熱處理脫毒

通常在較高溫度下，由病毒引起的病害癥狀會減輕，甚至有些新生葉片可以快速恢復健康，這一現(xiàn)象稱為“高溫隱癥”，是人們采用熱處理進行脫毒處理的最初依據(jù)[21]。Harrison[22]推測病毒在植株中的濃度代表復制和降解的平衡，而溫度的升高可以促進病毒的降解活性。目前熱處理脫毒的機理還不是很明確，之前人們普遍認為病毒的鈍化溫度是高溫能夠脫除病毒的主要原因[23-24]，也有一些研究表明高溫會對植物體內(nèi)的防御酶及鈣信號傳導造成一定影響[25-27]。最近，一些學者在研究溫度與癥狀表現(xiàn)的關系時發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下病毒產(chǎn)生的siRNA量急劇增加，所以推測熱處理脫毒可能與RNA沉默有關[28-30]。

熱處理在葡萄病毒脫除的研究中應用比較廣泛，而且通常為獲得良好的脫毒效果，以熱處理與莖尖培養(yǎng)相結合的方式進行脫毒，研究表明，將熱處理與莖尖培養(yǎng)相結合的脫毒率較單純莖尖培養(yǎng)提高8.5%[31-32]。Monette[33]采用變溫熱處理（39°C/22°C）結合莖尖培養(yǎng)的方法對混合感染葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus， GFLV） 和南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus， ArMV）的葡萄植株進行脫毒處理，獲得了無扇葉病毒的再生植株，但脫毒率較低，并且所有植株均未脫除ArMV。Leonhardt等[34]在恒溫35 ℃條件下處理葡萄離體植株60 d，基本上脫除了感病植株中的GFLV、ArMV和GLRaV，97個再生植株中ELISA檢測病毒為陽性的只有4株。其他學者也通過熱處理結合莖尖培養(yǎng)的方法獲得過無病毒葡萄植株，但GFLV脫除率都相對較低[17，35-36]。采用熱處理的方法脫除GRSPaV也相對較為困難，Gribaudo等[18]研究表明熱處理在脫除GRSPaV時的效率不足20%。Maliogka等[37]采用變溫方法（40 °C/37 °C）處理感染GRSPaV的葡萄品種‘Mantilaria和‘Prevezaniko ，脫毒效率分別為39.62%和92.85%，說明采用熱處理的方法進行病毒脫除時，不同品種上同一種病毒的脫毒效率存在差異。Panattoni等[38]對混合感染GLRaV-1和GLRaV-3的葡萄樣品Vitis vinifera ‘Sangiovese進行37 °C恒溫熱處理，結果表明2種病毒的脫除率相似，均達55%以上。Diaz-Barrita等[39]對另一個同時感染這2種病毒的葡萄品種‘Chancellor進行脫毒處理，經(jīng)RT-PCR檢測表明恒溫熱處理（37.2 °C）20 d獲得的莖尖再生植株完全脫除了2種病毒。Maliogka等[37]研究表明GLRaV-Pr的熱處理脫毒效率也在90%左右。此外，Panattoni等[40]在恒溫36 °C條件下處理葡萄植株57 d，獲得了無GVA的植株，脫除率為60%。熱處理按照處理材料的類型存在2種形式，一是將盆栽的葡萄苗直接放在高溫下進行處理，然后再切取莖尖進行組織培養(yǎng)；另一種形式是先將葡萄植株進行組織培養(yǎng)獲得再生植株，然后對離體植株進行高溫處理。Gribaudo等[18]和Krizan等[41]都分別采用2種方式來脫除GFLV，結果表明盆栽苗直接熱處理的方式脫除率略高。在實際應用中2種方法各有優(yōu)勢，盆栽苗熱處理后可以從一個處理植株上獲得多個莖尖，從而降低了對處理植株數(shù)量的要求，而離體植株熱處理占用空間小，便于統(tǒng)一管理。熱處理不適于類病毒引起的葡萄病害，Gambino等[42]對感染葡萄黃斑類病毒-1（Grapevine yellow speckle viroid-1， GYSVd-1） 、啤酒花矮化類病毒（Hop stunt viroid， HSVd）和GFLV的34株葡萄樣品進行恒溫（34 °C）熱處理，40～99 d后對再生植株進行帶毒情況檢測，發(fā)現(xiàn)所有植株中仍存在2種類病毒。

3 化學處理脫毒

人們在長期的研究中發(fā)現(xiàn)一些化學試劑可以延遲或抑制病毒復制，最初這些化學物質(zhì)主要在醫(yī)學領域用于動物病毒的防治，后來逐漸建立起以這些試劑的發(fā)展為基礎的植物病毒脫除技術體系。目前從病毒的吸附、滲透、脫衣殼到核酸復制和蛋白質(zhì)合成的各個環(huán)節(jié)都有相應的病毒抑制劑[43]。對于植物病毒來說，化學治療的主要策略是影響酶的合成，化學處理采用的試劑概括起來有以下幾種類型：次黃嘌呤單核苷脫氫酶（Inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH）、嘌呤生物合成抑制劑（Purine biosynthesis inhibitors）、神經(jīng)核苷酶抑制劑（Neuraminidase inhibitors）和SAH水解酶（S-Adenosilhomocysteine （SAH） hydrolase）等，通常將化學處理與莖尖培養(yǎng)結合起來進行病毒的脫除[44-45]。

在葡萄病毒的脫除中IMPDH類抑制劑應用較為廣泛，常用的IMPDH類抑制劑主要有病毒醚（Ribavirin）和噻唑羧胺核苷（Tiazofurin）等，其中病毒醚在葡萄病毒的脫除中應用最廣，其作用機理主要是抑制病毒mRNA的加帽和延伸，尤其是阻止鳥嘌呤核苷5磷酸的合成以及阻止已合成的mRNA帽子結構的甲基化反應，從而抑制病毒核酸的合成[46-47]。病毒醚對卷葉病毒的抑制效果不明顯，Stevenson等[48]通過采用不同濃度的病毒醚來處理葡萄樣品V. vinifera ‘Liemberger，結果卻發(fā)現(xiàn)病毒醚對卷葉病毒的抑制作用是暫時的，不能根本上脫除該類病毒。Gutǎ等 [49]在進行GLRaV-1的脫除研究中發(fā)現(xiàn)，病毒醚的抑制效果與再生植株的來源有一定聯(lián)系，對從植株頂端莖尖分化出的離體植株中的病毒沒有抑制作用，而對來源于第1個側芽的離體植株中的病毒有11%的抑制效率。利用病毒醚脫除GVA也比較困難，Panattoni等[40]研究表明經(jīng)20 μg·mL-1病毒醚處理60 d的15株感染GVA的葡萄植株中，只有8株ELISA檢測為病毒陰性，對這些陰性植株再進行RT-PCR驗證，均擴增出目標條帶，將病毒醚與一種SAH水解酶（Dihydroxypropyladenine adenine， DHPA）混用得到的GVA抑制率也只有40%。與卷葉病毒一樣，病毒醚對來源于植株頂端莖尖和第1個側芽的再生植株中GVA的脫除率差異也比較明顯，從植株頂端莖尖得到的再生植株中，GVA的脫除率只有33%，而從第1個側芽獲得的植株中可完全脫除該病毒[49]。病毒醚對GFLV脫除效果較好，可達94%[50]。與病毒醚不同，另一種IMPDH類試劑噻唑羧胺核苷對卷葉病毒的抑制率較高，研究表明噻唑羧胺核苷對GLRaV-1的脫除率為72%，而GLRaV-3的脫除率可達100%[45]。嘌呤生物合成抑制劑（如6-硫鳥嘌呤等）和神經(jīng)核苷酶抑制劑（如奧司他韋等）在葡萄病毒的脫除中應用較少，Panattoni等[44]利用6-硫鳥嘌呤等和奧司他韋進行GLRaV-3的脫除研究，結果表明2種試劑對該病毒的抑制作用相近，分別為75.1%和87%。Guta等[51]采用50 μmol·L-1奧司他韋脫除了GLRaV-1和 GLRaV-3，脫毒率為66.66%～71.42%。除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)一些中藥（如板藍根等）對葡萄病毒也有一定的抑制作用[52]。

4 體細胞胚胎發(fā)生脫毒

體細胞胚胎發(fā)生是指在適宜培養(yǎng)條件下植物離體培養(yǎng)的細胞、組織、器官可以產(chǎn)生類似胚的結構，進而發(fā)育成完整植株的過程。1958年，Reinert[53]和Steward等[54]首次報道了離體胡蘿卜組織培養(yǎng)體細胞胚胎發(fā)生，隨后在其他很多物種中也相繼報道，現(xiàn)在體細胞胚發(fā)生技術已被廣泛應用于不同的育種計劃中。20世紀70年代，Mullins等[55]首次報道了葡萄的體細胞胚胎發(fā)生。

近年來體細胞胚胎發(fā)生的方法在葡萄病毒的脫除中得到應用，已經(jīng)成功脫除了多種韌皮部限制性病毒和線蟲傳多面體病毒。Goussard等[56]通過體細胞胚發(fā)生的方法成功脫除了GLRaVs，但是在新生的分生組織中仍檢測到GFLV的存在。Borroto-Fernandez等[57]通過ELISA和IC-RT-PCR的方法對46株通過體細胞胚發(fā)生的方法獲得的葡萄再生植株進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)完全脫除了ArMV。對于病毒混合感染的葡萄樣品，采用體細胞胚胎發(fā)生的脫除率也很高，Gambino等[5]從混合感染GLRaV-1、GLRaV-3、GVA和GRSPaV的3個葡萄品種中都獲得了無病毒再生植株，同時發(fā)現(xiàn)，一般熱處理或莖尖培養(yǎng)的方法只能從1/3的感病植株中獲得無GRSPaV的葡萄植株，而采用體細胞發(fā)生的脫除率可達100%，同時，該方法在脫除GFLV時的效率也很高[58]。在葡萄類病毒的脫除研究中，體細胞胚再生的方法也表現(xiàn)出較高的脫除效率，Gambino等[42]對感染GYSVd-1和HSVd的4個葡萄樣品進行體細胞胚再生實驗，最后從花藥和子房的再生植株中均檢測不到2種類病毒，并且連續(xù)3 a對移栽溫室的樣品進行跟蹤檢測，結果均未發(fā)現(xiàn)類病毒的再次感染。此外，單純的體細胞胚再生的方法對于一些不受維管束限制的病毒（如GFLV）沒有獲得良好的脫除效果[56]，Goussard等[59]將體細胞再生得到的植株經(jīng)恒溫35 ℃處理60 d后成功脫除了GFLV。

5 超低溫脫毒

超低溫貯存一般以液氮為冷源，在此低溫下，活細胞內(nèi)新陳代謝和生命活動幾乎完全停止，植物材料不會發(fā)生遺傳性狀的改變，但細胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能可保存。該技術具有存儲時間長、可最大程度的保持儲存胚的基因型和表型以及占用空間小等優(yōu)點，已廣泛用于溫帶和熱帶植物種胚的儲存[60]。Brison等[61]最早將超低溫存儲技術用于植物病毒的脫除研究中，并成功脫除了李屬（Prunus）砧木上的李痘病毒（Plum pox potyvirus， PPV），脫除率較傳統(tǒng)方法提高了30%。之后該方法在脫除芭蕉屬（Musa spp.）植物上的黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和香蕉環(huán)紋病毒（Banana streak virus， BSV）中得到應用[62]。