郝艷梅 馬佳 司晨晨 徐佳 景捷

[摘要] 目的 研究涎腺腺樣囊性癌（SACC）中β-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖（β-DG）的表達情況，探討金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）對SACC細胞表達β-DG的影響。方法 采用免疫細胞化學染色法檢測經(jīng)不同濃度（10、15、20、25 μmol·L-1）TIMPs作用后SACC肺高轉移株ACC-M和肺低轉移株ACC-2中β-DG的表達情況，以未經(jīng)TIMPs作用的ACC-M和ACC-2細胞作為對照。收集7例SACC患者的腫瘤組織樣本，以10例正常涎腺組織作為對照，采用免疫組織化學染色法檢測β-DG的表達情況。結果 未經(jīng)TIMPs作用前，ACC-2和ACC-M細胞均未見β-DG表達，經(jīng)不同濃度TIMPs作用后，ACC-2和ACC-M細胞β-DG表達均為陽性。10例正常涎腺組織中，β-DG主要表達于腺泡的基膜上；SACC組織的癌巢周圍及癌細胞中β-DG表達陰性。結論 SACC細胞外基質和細胞骨架連接處的β-DG發(fā)生了斷裂，可能使其更容易發(fā)生侵襲和轉移，而TIMPs能夠逆轉β-DG的表達，為治療SACC提供了新思路。

[關鍵詞] 金屬蛋白酶組織抑制劑； 涎腺腺樣囊性癌； β-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖

[中圖分類號] R 739.87 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.002

β-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖（β-dystroglycan，β-DG）是一種跨膜蛋白，是連接細胞外基質和細胞內(nèi)骨架的重要結構，對維持細胞膜的完整性和信號轉導起著關鍵性作用[1]。人類宮頸癌、乳腺癌、結腸癌、前

列腺癌患者會出現(xiàn)β-DG異常，舌鱗狀細胞癌患者有β-DG斷裂的現(xiàn)象[2]。涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，侵襲性較強。目前有關SACC中β-DG的研究尚不多見。本研究通過觀察細胞骨架與細胞外基質這一連接體是否發(fā)生斷裂，從抑制SACC基底膜和細胞外基質降解的角度出發(fā)，檢測金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）調(diào)控SACC肺高轉移株ACC-M和SACC肺低轉移株ACC-2表達β-DG的情況，探討SACC侵襲和轉移的機制，為治療SACC提供新的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

人SACC肺高轉移株ACC-M和人SACC肺低轉移株ACC-2購至武漢大學保藏中心。主要試劑：GM6001（屬于TIMPs的一種，美國Enzo Life Sciences Interna-tional公司產(chǎn)品），胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液（HyClone公司，美國），含0.02%乙二胺四乙酸（ethylenedia-

mine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%胰蛋白酶（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司），一抗Beta-Dystro-glycan mouse monoclonal antibody（Novocastra Labo-ratories Ltd.，英國），SP9002（生物素標記山羊抗小

鼠IgG）HistostainTM-PlusKits免疫組織化學染色試劑盒、ZLI-9018DABKit/DAB濃縮型DAB試劑盒（北京

中杉金橋生物技術有限公司）。主要實驗儀器：CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司），倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)，冰凍切片機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將ACC-M和ACC-2用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，當細胞長滿80%時進行細胞傳代。

1.2.2 GM6001儲存液制備 將1 mg GM6001粉末溶于100 μL二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）后配制成25 μmol·L-1的儲存母液，過濾除菌后，置于

-20 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。使用時稀釋，使GM6001濃度分別為25、20、15、10 μmol·L-1。

1.2.3 細胞爬片制備 使用臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)，確定活細胞數(shù)達到全部細胞的95%以上，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細胞（密度為每毫升5×104個），接種于經(jīng)滅菌處理的蓋玻片上，待細胞貼壁后，去除培養(yǎng)液，按照實驗分組在適宜的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 實驗分組 對照組加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；實驗組分別加入含GM6001濃度為10、15、20、25 μmol·L-1的培養(yǎng)液，于同樣條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.5 免疫細胞化學染色法檢測ACC-M和ACC-2中β-DG的表達 將細胞爬片置于冰面上，用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗片3次，每次5 min；將細胞爬片浸入過氧化氫/甲醇溶液（150 μL 30%過氧化氫溶于50 mL甲醇液）中，室溫浸泡30 min，再用PBS液洗片3次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，室溫下作用30 min，甩去多余液體，不洗。實驗組加一抗（一抗與無菌三蒸水的體積比為1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS洗片；對照組不加一抗，以PBS液孵育，4 ℃過夜后，PBS洗片。上述步驟完成后，滴加二抗，于37 ℃孵育60 min，PBS洗片；然后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素親和素復合物于切片上，作用30 min，PBS洗片；最后DAB顯色，自來水洗滌，蘇木精復染15 s，脫水，透明，封片，置于光學顯微鏡下觀察，數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)成像。結果判定：細胞核為藍色，β-DG陽性表達者呈棕黃色。

1.2.6 臨床標本中β-DG的表達 選擇2010年12月—2012年6月在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院口腔頜面外科住院治療的7例SACC患者采集標本?；颊咝g前未經(jīng)任何治療，所有病例均經(jīng)病理診斷后確診，所有患者均行手術治療。7例患者中，男4例，女3例；年齡42～68歲，平均55歲；病史1～6個月，平均3.5個月；原發(fā)部位在左側者2例，右側者5例。另外取10例涎腺組織作為對照，其中5例取自舌下腺囊腫的正常舌下腺組織，3例取自腮腺多形性腺瘤瘤旁正常組織（切緣在腮腺下極距病灶約1 cm處），2例取自腮腺腺淋巴瘤瘤旁正常組織。所有標本均于術中切取，大小約1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，立即放入凍存管并投入液氮中保存?zhèn)溆?。在制作冰凍切片的過程中，切片機的溫度要維持在-20 ℃。切片完成后在冰面上用冷丙酮和甲醇固定4 min，PBS反復沖洗，再將冰凍切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫浸泡30 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS液洗片，滴加山羊抗小鼠血清封閉液，室溫下作用60 min，甩去多余液體，不洗，后續(xù)步驟同1.2.5。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 用Image Pro-Plus 6.0病理細胞圖像分析系統(tǒng)，將各組免疫細胞化學結果進行圖像分析，每張切片至少選取5個高倍（40×10倍）視野，

計算出平均光密度值。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，不同濃度的GM6001分別干預ACC-M和ACC-2細胞24 h后β-DG表達變化的比較采用單因素方差分析，ACC-M和ACC-2兩種細胞株β-DG表達變化的比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 加入GM6001后對ACC-M和ACC-2細胞株β-DG

表達的影響

加入不同濃度GM6001后，用免疫細胞化學法檢測ACC-M和ACC-2細胞株中β-DG的表達，結果見表1：實驗組與對照組β-DG表達的差異有統(tǒng)計學意義（ACC-M：F=60.247，P<0.05；ACC-2：F=34.453，P<0.05）；GM6001濃度為20 μmol·L-1時，ACC-M和ACC-2中β-DG表達量的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），

其余3種濃度下，ACC-M和ACC-2中β-DG表達量的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

加入GM6001前后ACC-M和ACC-2細胞株中β-DG表達的情況見圖1～4：加入GM6001前（對照組），

ACC-M和ACC-2細胞株中均無β-DG表達；加入GM6001后，2種細胞株中β-DG表達均為陽性。

2.2 臨床標本中β-DG的表達

2.2.1 正常涎腺組織β-DG的表達 正常涎腺組織中β-DG主要位于腺泡基膜上。圖5為正常舌下腺組織，可見舌下腺腺泡的外周有一層基膜包繞，基膜β-DG染色為陽性。

2.2.2 SACC組織β-DG的表達 7例SACC臨床標本中，癌巢周圍及癌細胞中β-DG表達均為陰性。圖6

中SACC組織呈管狀型，腫瘤細胞排列呈小管狀或條索狀結構，管狀結構的內(nèi)層襯有導管細胞，外層為腫瘤肌上皮細胞，均未見β-DG陽性染色。

3 討論

β-DG是廣泛表達于各種組織的跨膜糖蛋白，其功能很復雜，與細胞和基底膜的連接有關，而細胞與基底膜的連接對腫瘤細胞的侵襲和轉移至關重

要[3]。在胃癌的研究[4]中，β-DG是一種功能性蛋白，在原發(fā)性腫瘤和轉移性淋巴結中表達降低。在SACC中的表達情況，目前尚不明確。

SACC約占涎腺腫瘤的10%，易沿神經(jīng)擴散發(fā)生遠處轉移，其遠處轉移的機制尚不清楚，對其預防和治療尚無有效的方法。DeAngelis等[5]對24例SACC患者進行了長達22年的臨床回訪，發(fā)現(xiàn)患者5、10、20年的生存率分別為92%、72%、54%。對于SACC治療方式的選擇和預后的評估可能需要結合一些實驗室檢測指標。

β-DG是基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotei-

nase，MMPs）的靶點。β-DG被MMPs降解后，造成

β-DG復合體斷裂， 使上皮細胞與細胞外基質的連接出現(xiàn)斷裂[6-7]。本實驗運用免疫組織化學法檢測臨床組織標本，結果發(fā)現(xiàn)：正常涎腺組織表達β-DG，提示β-DG對維持正常涎腺的結構和功能有重要作用；7例SACC組織中β-DG表達缺失，提示細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的連接發(fā)生了斷裂，意味著癌細胞失去了自限性，獲得向鄰近正常組織侵襲和轉移的能力。應用ACC-M和ACC-2兩種細胞株進行體外研究，β-DG的表達情況與組織學的研究結果一致。

TIMPs是MMPs的天然抑制劑，正常情況下在組織細胞中MMPs和TIMPs處于一種相對平衡的狀態(tài)[8]，如果這種平衡被打破，細胞就會出現(xiàn)病理學表現(xiàn)。有研究[9]表明，TIMP-1會干擾由某些因子的受體復合

物介導的凋亡作用，并能阻止病變發(fā)展和促進組織修復。由此可以推測，通過TIMPs調(diào)控MMPs有可能逆轉β-DG的異常表達，從而影響SACC的侵襲和轉移，這為治療SACC提供了新思路。本研究中，ACC-M和ACC-2兩種細胞株的β-DG表達均為陰性，經(jīng)GM6001干預后，ACC-M和ACC-2的細胞膜均出現(xiàn)了棕黃色的β-DG表達區(qū)域，這說明GM6001能夠抑制SACC中β-DG的斷裂，而且對β-DG的調(diào)控是通過抑制MMPs對基底膜的降解實現(xiàn)的。本研究還比較了不同濃度的GM6001干預ACC-2和ACC-M細胞株24 h后β-DG表達的變化，結果提示，低轉移細胞株ACC-2在10、15、25 μmol·L-1的GM6001調(diào)控下，β-DG表達較高轉移細胞株ACC-M為高，說明GM6001對ACC-2中異常β-DG的調(diào)控作用比ACC-M明顯，其機理還需后續(xù)的研究來證實。

本實驗分別從細胞和組織水平展開研究，檢測到SACC中β-DG表達缺失，通過GM6001的調(diào)控，ACC-M和ACC-2兩種細胞株均可恢復β-DG的表達。本研究證實了GM6001能夠逆轉SACC中β-DG的表達，為治療SACC提供了參考，但其機理還需要進一步研究。

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（本文采編 周學東）