劉怡彤，段振華，2，* ，馬華林，李 霜，張 雄，李婧怡

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228;2.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口570228)

黃秋葵(Abelmoschus esculentus(L.)Moench)，為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，別名秋葵夾、羊角豆等，原產(chǎn)于非洲，現(xiàn)在全國各地均有栽培［1］。黃秋葵含有豐富的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、礦物質(zhì)、多糖、黃酮和多酚類化合物等多種生物活性成分［2－4］。豐富的生物活性物質(zhì)使得黃秋葵具有抗疲勞［5］、提高機(jī)體免疫力、減少肺損傷和抗癌等作用［6－7］，臨床上已經(jīng)應(yīng)用于治療皮膚癌［8］、燙燒傷等疾病的治療。有研究表明［9］黃秋葵多糖具有體外結(jié)合膽酸的能力。多酚具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化活性、抗腫瘤、抗輻射以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等重要的生物活性功能［10］，但關(guān)于黃秋葵多酚的研究卻鮮有報(bào)道。因此開發(fā)研究黃秋葵多糖和多酚，對于黃秋葵資源的充分利用具有積極意義。超聲波輔助提取技術(shù)利用機(jī)械及熱力學(xué)特征產(chǎn)生極大的沖擊力與剪切力，產(chǎn)生空化作用，使細(xì)胞破碎，通過提高破碎速度來提高提取效率［11］。利用超聲波技術(shù)輔助提取植物中活性物質(zhì)具有減少溶劑用量，減少提取時(shí)間，降低提取溫度等優(yōu)點(diǎn)［12－14］。本實(shí)驗(yàn)以新鮮黃秋葵為原料，采用超聲波輔助提取技術(shù)，對黃秋葵水提液中多酚和多糖進(jìn)行研究，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定黃秋葵中多酚和多糖水提取的最佳工藝條件，以期為黃秋葵的產(chǎn)品研發(fā)和有效開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵新鮮嫩果 ?？谑心蠂?沒食子酸分析標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%) 阿拉丁試劑公司;福林酚(FC)、碳酸鈉、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸 均為國產(chǎn)分析純。

KS－300E超聲波清洗機(jī) 寧波科生儀器廠;101－2型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司;7200可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;IKA A11 basic分析用研磨機(jī) 德國儀科;HH－S26S電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠;BS124S電子天平 Sartorius公司;SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TDZ5－WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝流程 新鮮黃秋葵→蒸餾水清洗→去蒂→打漿→加入一定量蒸餾水→攪拌均勻→超聲處理→抽濾→濾液離心→提取液

1.2.2 多酚的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:采用福林－酚法［15］。精密稱取20mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水溶解并定容至 200mL，分別吸取 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各補(bǔ)水至0.5mL。然后加入10%FC試劑2.5mL，充分搖勻。反應(yīng)5min后加入7.5%Na2CO3溶液5mL，50℃水浴鍋中反應(yīng)5min。室溫避光保存1h。于波長760nm處測定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程結(jié)果為:Y=5.3986X+0.0202，R2=0.9954，其中Y:吸光度;X:沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)。

樣品測定:吸取提取液0.5mL，按上述步驟操作測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和料液比計(jì)算黃秋葵多酚得率。

1.2.3 多酚含量的計(jì)算 根據(jù)公式計(jì)算多酚得率:多酚含量(mg/g)=黃秋葵多酚質(zhì)量(mg)/黃秋葵質(zhì)量(g)。

1.2.4 多糖的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:采用苯酚－硫酸法［16］。精密稱取100mg干燥至恒重的葡萄糖，蒸餾水溶解并定容至1000mL，分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖溶液，各補(bǔ)水至1.0mL。然后加入6%苯酚溶液1mL，充分搖勻后加入濃硫酸5mL，迅速搖勻后室溫放置30min，于波長490nm處測定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程結(jié)果為:Y=9.5871X+0.0065，R2=0.9983，其中 Y:吸光度;X:葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)。

樣品測定:量取一定量提取液，加入三倍量95%乙醇，于4℃冰箱過夜保存。抽濾取沉淀后復(fù)溶于水。取1mL復(fù)溶液，按上述步驟操作測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和料液比計(jì)算黃秋葵多糖得率。

1.2.5 多糖含量的計(jì)算 多糖含量(mg/g)=黃秋葵多糖質(zhì)量(mg)/黃秋葵質(zhì)量(g)

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn) 選定超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度和超聲功率四個(gè)因素作單因素實(shí)驗(yàn)，在其他因素不變的情況下，考察各個(gè)單因素對黃秋葵多酚和多糖得率的影響。

1.2.7 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度和超聲功率為考察因素，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，對超聲提取黃秋葵水溶液多酚和多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 工藝優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定料液比為1∶40，超聲溫度為50℃，超聲功率為120W，改變超聲時(shí)間為 30、60、90、120、150min。考察超聲時(shí)間對黃秋葵多酚和多糖含量的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲時(shí)間對含量的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on yield

由圖1可以看出，隨著超聲時(shí)間的增加，多酚和多糖的含量先明顯增大，當(dāng)時(shí)間增加至90min時(shí)，隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，得率又出現(xiàn)減小的趨勢。這可能是因?yàn)殚L時(shí)間的超聲處理破壞了產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，加劇了多酚物質(zhì)的氧化，導(dǎo)致多酚含量下降;同時(shí)使得大分子多糖的糖苷鍵斷裂，從而導(dǎo)致多糖含量下降［17］。

2.2 料液比對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定超聲時(shí)間為90min，超聲溫度為50℃，超聲功率為 120W，改變料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。考察料液比對黃秋葵多酚和多糖含量的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對含量的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on yield

由圖2可以看出，隨著料液比的增大，多酚含量呈現(xiàn)明顯增加趨勢，在1∶40料液比時(shí)出現(xiàn)最大值，隨后減小。多糖增加趨勢較為平緩，也在1∶40出現(xiàn)最大值。這可能是因?yàn)殡S著料液比的增大，細(xì)胞壁內(nèi)外的物質(zhì)濃度差增大，增大了擴(kuò)散速度，從而促進(jìn)物質(zhì)溶出。而當(dāng)料液比增加到一定程度之后，水分子分散了超聲波對有效成分的作用，導(dǎo)致細(xì)胞破碎不完全，從而降低得率［18］。

2.3 超聲溫度對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定超聲時(shí)間 90min，料液比1∶40，超聲功率120W，改變超聲溫度為 30、40、50、60、70℃?？疾斐暅囟葘S秋葵多酚和多糖含量的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲溫度對含量的影響Fig.3 Effect of ultrasound temperature on yield

由圖3可以看出，在30～40℃時(shí)，多酚和多糖含量都有所增加，40℃之后，隨著溫度增加，兩者得率均持續(xù)減小，在60℃之后變化平緩。因?yàn)辄S秋葵酚類化合物在較高的溫度下容易發(fā)生氧化，所以溫度的升高會(huì)導(dǎo)致多酚含量下降;提取溫度過高也會(huì)引起水溶性多糖分子結(jié)構(gòu)的破壞［19］。隨后含量變化平緩，這可能是因?yàn)榇蟛糠侄喾优c多糖已被高溫破壞，只有少量結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的酚類與多糖未被破壞，溶解于提取液中。因此提取溫度選在40℃。

2.4 超聲功率對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定超聲時(shí)間為90min，料液比為1∶40，超聲溫度為 40℃，改變超聲功率為 48、72、96、120、144W。考察超聲功率對黃秋葵多酚和多糖得率的影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲功率對含量的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on yield

由圖4可以看出，在超聲功率低于96W時(shí)，隨功率增大多酚含量明顯增大，當(dāng)超聲功率超過96W時(shí)，隨功率增大多酚含量逐漸減小。多糖在72W時(shí)出現(xiàn)最大值，72W與96W含量略有減小，但相差不大，因此考慮到多酚在96W出現(xiàn)最大值，超聲功率選在96W。多酚與多糖含量均先增大后減小可能是因?yàn)殡S著功率增大，超聲波空化作用更劇烈，分子擴(kuò)散就越劇烈。而當(dāng)超聲波功率達(dá)到一定值時(shí)會(huì)對多酚和多糖產(chǎn)生破壞作用，引起多酚和多糖物質(zhì)的分解［14，20］。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)表1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可以看出，影響黃秋葵多酚含量的因素次序?yàn)锳＞C＞B＞D，最優(yōu)組合為A2B3C3D2，影響黃秋葵多糖得率的因素次序?yàn)镃＞A＞D＞B，最優(yōu)組合為A2B3C3D1。黃秋葵多酚與多糖的最優(yōu)組合僅僅在D功率因素上存在差異?？紤]到在多酚和多糖兩種物質(zhì)中，目前對黃秋葵的研究主要集中在黃秋葵多糖，有大量研究表明黃秋葵多糖具有很多功能活性［9，21－23］，故選擇多糖的最優(yōu)組合 A2B3C3D1為最佳工藝條件即超聲時(shí)間90min，超聲溫度45℃，料液比1∶45，超聲功率84W。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

選取超聲時(shí)間90min，超聲溫度45℃，料液比1∶45，超聲功率84W進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值為:多酚含量為 4.207mg/g，多糖含量為2.671mg/g。均高于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

超聲波輔助水提取黃秋葵多酚和多糖的最佳工藝條件為超聲時(shí)間90min，超聲溫度45℃，料液比1∶45，超聲功率84W，其中超聲時(shí)間是影響多酚和多糖得率的最主要因素。在該條件下水提取黃秋葵多酚和多糖的含量分別為4.207、2.671mg/g。

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