張藍(lán)寧,白 潔,李玉茹,楊 潔,徐 斌,王紅娟,張玉霄,盧才義*,尹 彤*

（解放軍總醫(yī)院: 1內(nèi)科臨床部老年心血管病研究所; 2南樓臨床部檢驗(yàn)科,北京 100853）

氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林抗血小板治療已成為臨床防治急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）或防止經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）后再發(fā)缺血事件的經(jīng)典治療方案[1,2]，但不同個(gè)體間存在明顯的氯吡格雷抗血小板反應(yīng)差異性[3]，因此準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)氯吡格雷抑制血小板聚集功能的水平就顯得非常重要。氯吡格雷通過阻斷血小板P2Y12受體發(fā)揮抗血小板作用[4]。阿司匹林使血小板的環(huán)氧酶（即前列腺素合成酶）乙酰化，從而抑制了環(huán)內(nèi)過氧化物的形成，血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的生成也減少。另外，它還可使血小板膜蛋白乙?；?，并抑制血小板膜酶，這也有助于抑制血小板功能[5]。臨床常用的檢測(cè)血小板功能的方法有：光密度比濁法（light transmission aggregation，LTA法）、血栓彈力圖法（thromboelastography，TEG法）、以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)法等，其中前兩者是臨床監(jiān)測(cè)患者服用抗血小板藥物療效的常用檢測(cè)方法[5]。目前尚無充分研究證實(shí)上述幾種方法檢驗(yàn)效能如何，不同情況下哪種檢測(cè)方法更加合適也暫未見相關(guān)報(bào)道，為此我們比較了LTA和TEG檢測(cè)腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）誘導(dǎo)的血小板聚集率。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

募集2010年9月至2012年9月期間，因ACS在解放軍總醫(yī)院住院且需服用氯吡格雷和阿司匹林雙聯(lián)抗血小板治療的患者，所有參加本試驗(yàn)的患者均需簽署書面知情同意書。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）18歲以上并且有完全行為能力；（2）性別不限；（3）診斷為ACS的患者，包括不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死以及ST段抬高型心肌梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已知雙聯(lián)抗血小板治療禁忌癥患者；（2）有慢性炎癥性疾病者；（3）服用甾體或非甾體抗炎藥者；（4）有活動(dòng)性出血、出血體質(zhì)、有出血傾向者以及血液疾病患者；（5）近1個(gè)月內(nèi)有深部穿刺及大手術(shù)病史（含眼科或腦科手術(shù)）；（6）可疑的主動(dòng)脈夾層、心包炎和亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎；（7）已知對(duì)研究藥物或器械過敏者（普通肝素、阿司匹林、氯吡格雷、不銹鋼、造影劑等）或過敏體質(zhì)者；（8）孕婦、哺乳期及有生育計(jì)劃的患者；（9）研究者認(rèn)為不適合參加本研究的任何情況。所有患者入院后均給予氯吡格雷（波立維?，Plavix?）75mg/d+阿司匹林腸溶片（拜阿司匹林?，Bayaspirin?）100mg/d口服抗血小板治療。

1.2 血小板聚集率的檢測(cè)方法

口服氯吡格雷24h內(nèi)抽取患者外周靜脈血2管（5ml/管），保存于EDTA管中，2h之內(nèi)送檢。分別用LTA（ADP濃度5ul/L）和TEG進(jìn)行檢測(cè)ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集率（ADP濃度5umol/L，AA濃度0.5mol/L）。若患者接受血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑（如替羅非班），則在停止用該藥24h后采血。采用LTA法檢測(cè)血小板聚集率步驟如下：（1）標(biāo)本收集：用3.8%枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管從肘前靜脈抽取5mL靜脈血，混勻。采血要熟練，盡量一針見血?；靹驎r(shí)手法要輕柔，不可劇烈晃動(dòng)。（2）富血小板血漿的制備：上述標(biāo)本于25～32℃以1000r/min離心10min，待離心機(jī)自然停止后取出（如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象應(yīng)重新采血），離心不要中斷。小心吸取上層血漿即為富血小板血漿，移至另一塑料試管并做標(biāo)志，注意勿吸入白細(xì)胞及紅細(xì)胞，放置30min后再進(jìn)行檢測(cè)。（3）貧血小板血漿的制備：制備富血小板血漿吸除上層血漿后的余下標(biāo)本以3000r/min離心5min，再吸取上層血漿即為貧血小板血漿。血小板數(shù)為（10～20）xl0/L。（4）用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)血小板，用貧血小板血漿調(diào)整富血小板血漿，檢測(cè)ADP誘導(dǎo)下的血小板聚集率。采用TEG法檢測(cè)AA誘導(dǎo)的血小板聚集率步驟如下：使用TEG凝血分析儀5000型（Haemoscope公司生產(chǎn)）；試劑包括高嶺土（含1%的kaolin液），激活劑F（由蝮蛇血凝酶和血小板XⅢa因子混合而成），AA（0.5mol/L）和ADP（5ul/L），上述試劑均由Haemoscope公司提供；使用4個(gè)通道進(jìn)行檢測(cè)：(1)高嶺土，（2）激活劑F，（3）激活劑F+AA，（4）激活劑F+ADP；患者于口服雙聯(lián)抗血小板藥物穩(wěn)定劑量后24h取靜脈血，包括1個(gè)肝素化抗凝管和1個(gè)枸櫞酸抗凝管。所有檢測(cè)均在取血后2h內(nèi)完成。觀察分別采用LTA法和TEG法測(cè)得各研究對(duì)象的ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集率（%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以±s表示計(jì)量資料，兩樣本組間的比較采用t檢驗(yàn)。用變異系數(shù)（Coefficient of Variance，CV）表示數(shù)據(jù)的離散程度。兩種檢測(cè)方法間進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，并進(jìn)行線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征

本研究共納入病例93例，男性63例，女性30例，年齡52～82歲，平均60.9歲，其他資料詳見表1。

表1 受試患者的一般臨床特征Table1 General characteristics of all subjects (n＝93)

2.2 LTA法和TEG法檢測(cè)的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率的相關(guān)分析

應(yīng)用LTA法檢測(cè)到的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率波動(dòng)在11%～97%之間，平均值為（59.3±21.34）%，CV為4.6%；應(yīng)用TEG法測(cè)得的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率波動(dòng)在4%～100%之間，平均值為（63.67±28.15）%，CV為7.9%。

采用直線相關(guān)模型分析發(fā)現(xiàn)，LTA法和TEG法檢測(cè)的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率呈正相關(guān)（r＝0.814，P＜0.0001）?；貧w方程為Y（比濁法）＝0.2+0.617X血栓彈力圖法（圖1）。

2.3 LTA法和TEG法檢測(cè)的AA誘導(dǎo)的血小板聚集率的相關(guān)分析

LTA法測(cè)得AA誘導(dǎo)的血小板聚集率波動(dòng)在1%～94%間，平均值（40.87±35.16）%，CV為12.4%。TEG法測(cè)得的血小板聚集抑制率波動(dòng)在0%～100%間，平均值為（46.02±39.26）%，CV為15.4%。

采用直線相關(guān)模型考察LTA法和TEG法測(cè)得的AA誘導(dǎo)的血小板聚集率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LTA法和TEG法檢測(cè)的AA誘導(dǎo)的血小板聚集率正相關(guān)（r＝0.965，P＜0.0001），回歸方程為^Y（比濁法）＝1.077 X血栓彈力圖法+0.02（圖2）。

圖1 LTA法和TEG法檢測(cè)的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率之間的相關(guān)分析Figure 1 Correlation analysis of ADP induced platelet aggregation rates assessed by TEP and LTA

圖2 LTA法和TEG法檢測(cè)的AA誘導(dǎo)的血小板聚集率之間的相關(guān)分析Figure 2 Correlation analysis of AA induced platelet aggregation rates assessed by LTA and TEG

3 討 論

血小板在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病形成和發(fā)展過程中起著重要的作用，抗血小板藥物已成為治療心血管疾病的基石之一[6]。ADP是引起血小板活化和聚集的關(guān)鍵介質(zhì)，它通過P2Y1和P2Y12這兩個(gè)G蛋白耦聯(lián)受體與血小板不可逆結(jié)合促使血小板結(jié)合并維持穩(wěn)定[7]。阿司匹林使血小板的環(huán)氧酶乙?；瑥亩种屏谁h(huán)內(nèi)過氧化物的形成，TXA2的生成也減少。另外，它還可使血小板膜蛋白乙?；?，并抑制血小板膜酶，這也有助于抑制血小板功能[5]。

目前氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙聯(lián)抗血小板治療已成為治療ACS和PCI后的經(jīng)典方案，但患者間存在明顯的抗血小板反應(yīng)性變異。因此快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)服藥后血小板功能成為臨床急需解決的問題。TEG分析儀是目前臨床常用的檢測(cè)手段之一。目前主要有普通檢測(cè)、TEG法和肝素酶對(duì)比檢測(cè)[8]。普通檢測(cè)采用枸櫞酸鈉抗凝全血綜合判斷患者凝血狀態(tài)；肝素酶檢測(cè)用于檢測(cè)患者對(duì)肝素、低分子肝素的反應(yīng)性；而TEG法主要用于檢測(cè)服用不同抗血小板藥物后機(jī)體反應(yīng)情況，其中ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率可反映機(jī)體對(duì)氯吡格雷、雙嘧達(dá)莫和血小板糖蛋白受體Ⅱb/Ⅲa抑制劑的反應(yīng)性，而AA誘導(dǎo)的血小板聚集率可反映機(jī)體對(duì)阿司匹林的反應(yīng)性[8,9]。LTA法也是臨床檢測(cè)ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集率的常用方法之一[10]。它和TEG相比，具有操作較為簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì)。

針對(duì)臨床醫(yī)生對(duì)上述兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致性、相關(guān)性的疑問，我們進(jìn)行了本項(xiàng)研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTA法和TEG法檢測(cè)同一患者ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集率，結(jié)果相關(guān)性較好。上述結(jié)果提示：對(duì)于服用氯吡格雷的ACS或PCI術(shù)后患者，LTA法和TEG法在檢測(cè)血小板聚集功能方面具有較好的一致性，可以互相補(bǔ)充。LTA法操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉，在做好質(zhì)控措施的前提下，可作為服用阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板藥物的ACS和PCI術(shù)后患者初篩、監(jiān)測(cè)和復(fù)測(cè)血小板活性的常規(guī)檢測(cè)手段。TEG法雖然操作繁瑣、費(fèi)用昂貴，但它的眾多檢測(cè)項(xiàng)目可動(dòng)態(tài)、綜合評(píng)估患者凝血狀況，不同的檢測(cè)指標(biāo)可檢測(cè)肝素、阿司匹林、氯吡格雷、替羅非班等多種藥物的抗血小板效果。

從本研究建立的線性模型中可以看出，兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性在血小板聚集率呈現(xiàn)極端值（較高或較低）時(shí)更好的趨勢(shì)。這一發(fā)現(xiàn)提示，應(yīng)用不同方法檢測(cè)的血小板聚集率在有血栓形成風(fēng)險(xiǎn)或出血風(fēng)險(xiǎn)的ACS患者中的一致性更強(qiáng)。

總之，在雙聯(lián)抗血小板治療的ACS患者中，采用TEG法和LTA法檢測(cè)的血小板功能具有較好的一致性。LTA法操作更加簡(jiǎn)便，費(fèi)用更加低廉，因此更適于用作臨床快速篩查抗血小板反應(yīng)性的檢測(cè)方法。而TEG法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)凝血全貌，更適合需全面評(píng)估凝血功能的危重癥患者。

[1]Sabatine MS,Cannon CP,Gibson CM,et al. Effect of clopidogrel pretreatment before percutaneous coronary intervention in patients with ST-elevation myocardial infarction treated with fi brinolytics: the PCI-CLARITY study[J]. JAMA,2005,294(10): 1224-1232.

[2]Chen ZM,Jiang LX,Chen YP,et al. Addition of clopidogrel to aspirin in 45,852 patients with acute myocardial infarction: randomised placebo-controlled trial[J]. Lancet,2005,366(9497): 1607-1621.

[3]Kolandaivelu K,Bhatt DL. Overcoming 'resistance' to antiplatelet therapy: targeting the issue of nonadherence[J]. Nat Rev Cardiol,2010,7(8): 461-467.

[4]Yin T,Miyata T. Pharmacogenomics of clopidogrel:Evidence and perspectives[J]. Thromb Res,2011,128(4):307-316.

[5]劉毅敏,罩 軍,王祥智,等. 血小板聚集檢測(cè)方法進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2004,19(4): 383-384.

[6]Davi G, Patrono C. Platelet activation and atherothrombosis[J]. N Engl J Med,2007,357(24):2482-2494.

[7]Trumel C,Payrastre B,Plantavid M,et al. A key role of adenosine diphosphate in the irreversible platelet aggregation induced by the PAR1-activating peptide through the late activation of phosphoinositide 3-kinase[J]. Blood,1999,94(12): 4156-4165.

[8]Park MS,Martini WZ,Dubiek MA,et al.Thromboelatography as a better indicator of hypercoagulable state after injury than prothrombin time or activated partial thromboplastin time[J]. J Trauma,2009,67(2): 266-275

[9]Gonzalez E,Kashuk JL,Moore EE,et al. Differentiation of enzymatic from platelet hypercoagu1abi1ity using the novel thrombelastography parameter delta[J]. J Surg Res,2010,163 (1): 96-101.

[10]Chen A, Teruya J. Global hemostasis testing thromboelastography: old technology,new applications[J].Clin Lab Med,2009,29(2): 391-407.