白 雁，李小慶，雷敬衛(wèi)

河南中醫(yī)學院，鄭州450046

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall的干燥根，為我國臨床常用傳統(tǒng)中藥，有養(yǎng)血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗的功能［1］，芍藥苷(paeoniflorin，PF)是白芍的主要有效成分之一［2］?！吨袊幍洹?010版已對白芍的質量控制做出明確的規(guī)定，在含量測定項中以芍藥苷為指標，利用高效液相色譜法對其進行含量測定，但該法需對藥材進行分離提取，耗時耗試劑，不適合中藥的快速檢測。近紅外分析技術是一種二次分析技術，其光譜信息來源于有機物中含氫基團 X-H(X=C、O、N、S、P)振動的倍頻和合頻吸收，因此其譜帶寬，組分之間譜帶重疊現象嚴重，不能用于直接分析，而是綜合多學科(光譜學、化學計量學和計算機等)知識的現代分析技術，具有快速、無損、可同時進行多項測定等優(yōu)點。因此，本研究嘗試用近紅外建立芍藥苷含量測定的新方法，對白芍中芍藥苷進行快速分析，以滿足中藥現代化的需求。

1 儀器與材料

美國Thermo Nicolet 6700型傅立葉變換近紅外光譜儀(漫反射積分球附件、OMNIC光譜采集軟件和TQ8．0分析軟件);Waters2695高效液相色譜儀(PDA2998紫外檢測器);METTLER TOLEDO AL204萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);HS-6150型超聲波清洗器(500W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司);FW-200型高速藥材粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);CS101-2D電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司);乙腈、甲醇為色譜純，水為市售純凈水。芍藥苷對照品(批號:1107036-201035，供含量測定用)由河南省藥檢所提供;106份白芍樣品由河南省宛西制藥股份有限公司提供。

2 實驗方法

2．1 近紅外光譜數據的采集

將106份白芍樣品粉碎過65目藥典篩，每份樣品取約8 g，混合均勻后放人石英樣品杯中，攤平，然后以空氣為參比，扣除背景，采集光譜圖。采樣方式:積分球漫反射;采集光譜范圍:4000 cm-1～12000 cm-1;分辨率:8 cm-1;掃描次數:32次;溫度:(25±2)℃;相對濕度:45% ～50%。每份樣品掃描3次，求平均值作為樣品的NIR光譜。

2．2 芍藥苷含量的HPLC測定

參照2010版《中國藥典》中白芍項下芍藥苷含量測定中HPLC進行測定。色譜柱為Diamonsil C18(200 mm × 4．6 mm，5 μm)，以乙腈-0．1% 磷酸溶液(14∶86)為流動相，檢測波長230 nm，柱溫25℃，流速1．0 mL/min，進樣體積10μL，以保留時間定性，峰面積定量，外標法計算。每份樣品平行做2次，以其平均值作為HPLC分析值。

2．3 芍藥苷定量分析模型的建立

依據芍藥苷的含量分布，從106份白芍樣品中選擇20個作為驗證集，其余作為校正集，將驗證集和校正集的NIR光譜與HPLC分析值相關聯，輸入到TQ8．0軟件中，選擇不同的光譜預處理方法，建模譜段以及主因字數建立定量校正模型，所建模型用相關系數(R2)和內部交叉驗證均方差(RMSECV)來評價，R2越接近于1，RMSECV越小，表明模型結構越合理，其預測能力可通過預測均方差(RMSEP)來衡量，RMSEP越小，表明模型的預測性能和推廣能力越強［3］。

3 結果與討論

3．1 白芍樣品NIR圖譜的采集

106份白芍樣品的近紅外光譜疊加圖見圖1。

3．2 白芍樣品的芍藥苷含量測定

圖1 106份白芍樣品的近紅外光譜疊加圖Fig.1 NIRS spectra of106 Paeoniae Radix Alba samples

按2．3項下的方法對106份白芍樣品中芍藥苷含量進行了測定，其含量范圍為1．32% ～3．49%，并以此值作為建立近紅外模型的真實值。

3．3 白芍中芍藥苷定量校正模型的建立

3．3．1 校正集和驗證集的選擇

運用TQ8．0定量分析軟件中PLS法建立模型。根據白芍樣品中芍藥苷含量分布情況，從106份白芍樣品中選擇86個樣品作為校正集，20個樣品作為驗證集。為使校正集樣品更具代表性，驗證集樣品的芍藥苷含量應在校正集含量范圍之內［4］，見表1。

表1 校正集與驗證集中芍藥苷含量分布Table 1 Concentration distribution of paeoniflorin of calibration set and validation set

3．3．2 光譜預處理方法、光譜范圍及主因子數的選擇

在建立模型前，首先對樣品的原始吸收光譜進行預處理。本實驗進行的是粉末樣品的NIR漫反射采集，由于樣品顆粒尺寸、均勻性等的影響，光程無法保持恒定，不利于建模時有效信息的提取，因此本實驗用標準正則變換(SNV)和多元散射校正(MSC)來對光譜進行處理，以消除這些因素的干擾。導數處理是凈化圖譜、消除光譜偏移或漂移的常用方法，可根據需要進行一階導數(First Derivative)和二階導數(Second Derivative)處理。但導數處理在消除基線偏移的同時，也放大和分離了重疊的信息，放大了噪聲信號，因此，在對光譜進行微分處理時，需對光譜進行平滑處理，常用的平滑的處理方法有Savitzky-Golay濾波和Norris Derivative濾波。預處理方法對R2、RMSECV及RMSEP的影響如表2所示，由表2知最優(yōu)預處理方法為MSC+First De- rivative+SG。

表2 不同預處理方法對校正模型影響Table 2 Calibration results with different preprocessingmethods

手動優(yōu)選最佳波段，輔以R2、RMSECV及RMSEP作為模型性能的評價指標。通過比較，確定4014．56 ～ 7503．91 cm-1為最佳波段，如表3所示。

表3 不同建模區(qū)間對模型性能的影響Table 3 The effect of different spectral regions onmodel performance

圖2 主因子數對模型RMSECV的影響Fig.2 The RMSECV value with differentmain factors

本文采用交互驗證法考察主因子數對RMSECV的影響(圖2)，當RMSECV最小時，所選主因子數最佳［5］，由圖2知最佳主因子數為11，此時 RMSECV=0．33068。

3．3．3 白芍中芍藥苷定量模型的建立

采用以上確定的最優(yōu)條件，即106份白芍樣品的近紅外光譜經過MSC+FirstDerivative+SG處理后，在 4014．56 ～ 7503．91 cm-1波段范圍內，選擇前11個主成分建立最優(yōu)校正模型，NIR預測值與參考值相關圖見圖3，偏差圖見圖4。由圖知，該模型R2=0．99395，RMSECV 及 RMSEP 分別為 0．33068、0.0756，可以看出NIR預測值與參考值非常接近。

Vol.25 白 雁等:近紅外光譜法快速測定白芍中芍藥苷含量36 1

圖3 芍藥苷的NIRS預測值與真實值的相關圖Fig.3 Correlation between NIR predicted value and actual value

圖4 NIR預測值與真實值偏差圖Fig.4 Deviation between NIR predicted value and actual value

3．4 芍藥苷定量模型的內部驗證

將20份驗證集樣品的NIR圖譜輸入定量分析模型，預測其芍藥苷含量，并與其HPLC測得值進行比較，結果見表4。

表4 NIR預測值與HPLC測定值的比較Table 4 Comparison of NIR predicted value and actual value

由表4知，最大絕對偏差0．17%，以驗證集樣品的NIR預測值與HPLC測定值的比值作為預測回收率，所得平均回收率100．07%，結果表明，利用近紅外光譜技術測定白芍藥材中芍藥苷的含量是可行的。

3．5 統(tǒng)計學檢驗

將20份驗證集樣品的NIR預測值與HPLC測得值進行配對t檢驗，結果，t=-1．44，雙側P=0.887 ＞0．05，按 α =0．05 水準不拒絕H0，差異無統(tǒng)計學意義，即2種方法的分析結果差異無統(tǒng)計學意義，該模型可以準確預測其覆蓋范圍內的白芍藥材中芍藥苷含量。

3．6 討論

NIR定量模型的反復優(yōu)化過程中，性能指數(Performance Index，PI)即相對殘差和是確定最優(yōu)模型的一個重要參數，最大值是100，越接近100表明所建模型精度越好。在3．2項預處理方法選擇中，預處理方法為MSC+ First Derivative時R2=0.99425為最高，預處理方法為MSC+First Derivative+SG時RMSECV和RMSEP為最低，無法確定最優(yōu)模型。而預處理方法為MSC+First Derivative時模型的PI為86．9低于預處理方法為MSC+First Derivative+SG時的87．3，因此，確定最優(yōu)的光譜預處理方法為MSC+First Derivative+SG。

本實驗將NIRS與PLS相結合，建立了白芍中芍藥苷定量校正模型，該模型的R2=0．99395，RMSECV 及 RMSEC 分別為0．33068、0．0563，預測均方差(RMSEP)和平均回收率分別為 0．0756和100.07%。表明該模型準確、可靠，可以準確預測其覆蓋范圍內的白芍藥材中芍藥苷含量。但該模型建模所用樣本均由一個廠家提供，樣品來源略顯單一，因此，需要不斷增加樣品集數量，對模型進行再校正和優(yōu)化，提高模型的適用性和穩(wěn)健性，更好的應用于實際當中，以滿足中藥現代化的需求。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會)．Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典)．Beijing:China Medical Science Press，2010，Vol I．97．

2 Sun LR(孫麗榮)，Cao X(曹雄)，Hou FQ(侯鳳青)，et al．Progressive studies of paeoniflorin．China J Chin Mat Med(中國中藥雜志)，2008，33:2028-2032．

3 Bai Y(白雁)，Li S(李姍)，Wang X(王星)，et al．Determination of chlorogenic acid of honeysuckle by near-infrared spectroscopy rapidly．Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2011，17(5):66-69．

4 Zhang SN(章順楠)，Yang HL(楊海雷)，Liu ZQ(劉占強)，et al．On-line monitoring the contents of active components in the solution for Fufangdanshen dripping pills by near-infrared spectroscopy．JPharm Anal(藥物分析雜志)，2009，29:192．

5 Lu WZ(陸婉珍)．Modern Near Infrared Spectroscopy Analytical Technology(現代近紅外光譜分析技術)．Beijing:China Petreochemical Press，2007．44．