陳莉華，肖 斌，賀誠志，朱 健

吉首大學化學化工學院，吉首416000

金銀花為忍冬科多年生半常綠纏繞植物，又名忍冬花、銀花、雙花等［1］，在醫(yī)院臨床和中成藥生產(chǎn)中應用廣泛。研究表明，金銀花葉莖藤和金銀花在臨床上均有清熱解毒之功效，尤其是葉的有效成分和藥理作用不亞于花［2-4］，但藥源遠比金銀花豐富，且采集容易，價格便宜。金銀花葉莖藤中除含有綠原酸外，還含有黃酮類化合物［3-6］，研究金銀花葉莖藤中的黃酮的提取及純化工藝，可為金銀花藥材資源的充分利用提供一定的參考和依據(jù)。

大孔樹脂吸附分離技術可顯著提高有效成分的相對含量，具有價廉、吸附容量大，周期短、可重復使用等優(yōu)點，在天然產(chǎn)物有效成分的精制純化中已被廣泛應用［2，3，5-7］。本文采用超聲波法從金銀花葉莖藤中提取黃酮類化合物，用最常見的D101大孔吸附樹脂純化提取物，以黃酮的單位吸附量、吸附率和解吸附率為評價指標，對金銀花葉莖藤總黃酮在樹脂上的動態(tài)吸附和解吸工藝條件進行了優(yōu)化，并深入探討了吸附機理，為深入利用金銀花資源提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1．1 儀器和材料

UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津);KQ-250E超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司);R-201B-II旋轉蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);pHS-25酸度計(上海日島科學儀器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);HH-S恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);層析柱(直徑∶長度1∶8);粉粹機。蘆丁標準品(比利時進口，北京化學試劑有限公司);無水乙醇、石油醚、D-101 大孔樹脂、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、HCl(以上試劑均為分析純)。

1．2 實驗方法

1．2．1 D-101大孔吸附樹脂的預處理

稱取80 g D-101大孔吸附樹脂加入3 BV無水乙醇充分浸泡24 h，蒸餾水洗至無醇味;然后加入2 BV 5%稀鹽酸浸泡12 h，蒸餾水沖洗樹脂至流出液pH值為中性;最后加入2 BV 5%氫氧化鈉溶液浸泡12 h，蒸餾水沖洗樹脂至流出液pH值為中性。

1．2．2 金銀花葉莖藤總黃酮的提取

稱取一定量的金銀花葉莖藤碎屑，加入60%的乙醇，置于超聲波發(fā)生器中，在溫度50℃下超聲30 min，重復2次，合并提取液，減壓旋蒸回收乙醇，濃縮液用3∶1的石油醚脫色至石油醚層基本無色，將下層濃縮液用1∶3(濃縮液體積∶乙醇體積)80%的乙醇浸泡并靜置16 h，最后將上層清液減壓回收乙醇后得到黃酮提取液。

1．2．3 樣品中黃酮含量的測定

以蘆丁為黃酮對照品按NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法繪制標準曲線并用于測定粗提液和純化液中黃酮含量。用紫外可見分光光度計測波長在510 nm處的吸光值A，以濃度(c)對吸光值A進行線性回歸，得回歸方程為:c=0．0939A(R2=0．9998)。濃度在0～0．05 mg/mL之間具有良好的線性關系。取黃酮樣品溶液(粗提液或純化液)1．0 mL，置于25 mL容量瓶中，按照繪制蘆丁標準曲線的方法測定吸光值，計算黃酮提取率及黃酮純度。

1．2．4 各種試驗條件對吸附效果的影響

精確稱取經(jīng)預處理好的D-101大孔吸附樹脂2．0 g，裝入具塞錐形瓶中，依次改變實驗條件，考察樣品液濃度、料液比、樣品液pH值、不同靜置時間等因素對吸附效果的影響。

1．2．5 D-101大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學實驗

稱取預處理好的D-101大孔吸附樹脂2．0 g，加入50 mL黃酮濃度為0．538 mg/mL的樣品溶液，常溫振蕩吸附24 h，前120 min每隔15 min取樣，120 min后，每隔60 min取樣測一次吸光度。計算吸附平衡后溶液中總黃酮的濃度［8］。

1．2．6 吸附等溫線及吸附熱力學

分別在溫度 30、40、50、60、70 ℃ 下用 D-101 大孔樹脂吸附至飽和，測定吸附平衡時黃酮的濃度，計算其單位吸附量及平衡濃度，得到不同溫度下的吸附等溫線［6，9］。

1．2．7 不同體積分數(shù)的乙醇洗脫液對大孔樹脂解吸率的影響

精密稱取預處理好的D-101大孔樹脂2．0 g，濕法裝柱，加入一定量的樣品溶液，吸附完全后，分別加入35、45、55、75、85 和 95% 乙醇溶液 30 mL 進行洗脫，控制流速為2 mL/min，收集洗脫液并測定洗脫液中黃酮的含量，計算解吸率，考察乙醇洗脫液對大孔樹脂解吸附率的影響。

1．2．8 動態(tài)洗脫曲線

在動態(tài)吸附實驗確定的工藝條件下，使金銀花黃酮水溶液通過D-101大孔樹脂柱，直至吸附飽和，然后用75%的乙醇溶液以2 mL/min的流速進行動態(tài)洗脫，洗脫液分段收集，每5 mL收集1份，并測定每份溶液中總黃酮的濃度，繪制洗脫曲線。

2 結果與討論

2．1 影響吸附效果的各種因素

2．2．1 樣品液濃度對吸附效果的影響

圖1 樣品液濃度對樹脂吸附率的影響Fig.1 Effect of sample solution concentration on adsorption rate

由圖1可知樣品液濃度是大孔樹脂吸附過程中的一個重要影響因素。在實驗濃度范圍內(nèi)樹脂對黃酮的吸附率隨著樣品液濃度的增加而減小，D-101大孔樹脂對金銀花葉莖藤黃酮吸附的最佳濃度為0．5380 mg/mL，引起此現(xiàn)象可能原因為:隨著樣品液濃度的提高，總黃酮分子在樹脂內(nèi)部擴散能力可能降低，并且濃度增加后，與總黃酮競爭大孔樹脂吸附位點的雜質量也會增加，因而樹脂的目標吸附率反而會下降。

2．1．2 料液比對吸附效果的影響

用料液比代表所用大孔樹脂質量(g)吸附總黃酮溶液體積(mL)，實驗結果表明，當料液比為1∶5時大孔樹脂吸附率為79．06%，當料液比為1∶2時，吸附率維持不變，但浪費樹脂;當樹脂用量不變而增大黃酮溶液體積時，吸附率幾乎成線性下降，表明樹脂用量太少，吸附無法達到飽和。所以1∶5的料液比為最佳選擇。

2．1．3 樣品液pH值對吸附效果的影響

圖2 pH對吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption rate

從圖2可以看出，pH值較小時，大孔樹脂對黃酮的吸附率較低，當pH為2時，樹脂的吸附率達到最大值，隨著pH值的升高，大孔樹脂對黃酮的吸附率逐漸降低，選擇最佳pH值為2。

2．1．4 靜置時間對吸附率的影響

實驗結果表明隨著靜置時間的增大樣品吸附率升高，靜置時間到80 min時的吸附率達到最大，為97．4%，靜置時間繼續(xù)增加，吸附率反而減小。

2．2 吸附動力學

2．2．1D-101大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學特性

吸附過程的動力學主要研究吸附過程的速率，吸附速率控制固-液界面上吸附質的滯留時間。按照實驗方法得到吸附量隨時間變化的動力學曲線，結果見圖3。

圖3 樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.3 Static adsorption curve

如圖3可知，D-101大孔樹脂對金銀花葉莖藤中總黃酮的吸附為快速平衡型，開始單位吸附量變化較大，100 min以后單位吸附量隨時間增大緩慢，210min以后吸附量基本不再變化，表明在實驗條件下吸附達到了平衡。平衡時吸附量為8．06 mg/g。

圖4 準二級吸附動力曲線Fig.4 Pseudo-second adsorption kinetic curve

2．2．2 吸附速率常數(shù)

將圖4中實驗數(shù)據(jù)用Pseudo-second-order模型進行處理［11］，其線性方程表示如下:式中:K為表觀吸附速率常數(shù)，q和q分別為反te應時間t和平衡時樹脂的吸附量，以對t做圖得圖3，求得直線方程及對應的相關系數(shù)為為:y=0.1198x+1．4926，r=0．9999，結果表明 D-101 大孔樹脂對金銀花葉莖藤浸出液中黃酮的吸附動力學可用Pseudo-second-order模型描述，由擬合線性方程式可得表觀吸附速率常數(shù)K25℃=1．034×10-2g/mg·min。

2．3 吸附熱力學

2．3．1 吸附等溫線

為了研究吸附劑與被吸附物質之間的相互作用以及各類參數(shù)對吸附狀態(tài)的影響，本文采用最常見的 Langmuir 等溫吸附方程［9，10］對吸附等溫線數(shù)據(jù)進行擬合，以描述其吸附機制。配制系列不同濃度的金銀花葉莖藤浸出液，不同溫度下用D-101大孔樹脂吸附至飽和，測定吸附平衡時黃酮的濃度，計算其單位吸附量及平衡濃度，得到不同溫度下的吸附等溫線，結果見圖5。

圖5 不同溫度下的吸附等溫線Fig.5 Adsorption isotherms at different temperature

圖5表明隨著溶液中黃酮濃度的升高，D-101樹脂的單位吸附量增加，將圖5中實驗數(shù)據(jù)用Langmuir模型進行處理，其線性方程表示如下:

式中:Ce(mg/L)為溶液平衡濃度;qe(mg/g)為單位吸附量;Qm(mg/g)為飽和單位吸附量;a為Langmuir方程常數(shù)。以Ce/qe為縱坐標，Ce為橫坐標，繪制不同溫度下線性擬合等溫吸附曲線，其參數(shù)見表1。

表1 朗格繆爾等溫線常數(shù)和相關系數(shù)Table 1 Langmuir isotherm constants and correlation coefficients

由相關系數(shù)可知，用D-101樹脂對金銀花葉莖藤中的黃酮進行吸附時，其吸附模型可用Langmuir模型描述。從表中還可以看出，對于一定量的樹脂，本實驗采用35℃進行吸附效果最好，隨著溫度的升高，飽和單位吸附量下降，原因可能是樹脂吸附金銀花葉莖藤中的黃酮的過程是自發(fā)放熱的過程，溫度較高時，黃酮的溶解性增加，不利于黃酮分子與樹脂表面活性位點的結合，從而導致樹脂對其的吸附力降低。

2．3．2 D-101大孔樹脂吸附黃酮的焓變ΔH

D-101大孔樹脂吸附黃酮的焓變在吸附量一定時，吸附焓 ΔH可由 Vant Hoff方程［11］計算，Vant Hoff方程經(jīng)整理得下式:lg(1/Ce)=lgK+(-ΔH/RT);式中 R 為氣體常數(shù)(8．314 J/mol·K)，Ce為黃酮的吸附平衡濃度，K為常數(shù)。以lg(1/Ce)對1/T作圖，由直線的斜率計算ΔH，計算結果見表2。

表2 焓變ΔH隨吸附量的變化Table 2 The change ofΔH with adsorption capacity

由表2知，黃酮在D-101大孔樹脂上的吸附焓變?yōu)樨撝?，且絕對值均小于20 kJ/mol，表明吸附為放熱的物理吸附過程，低的ΔH值說明該樹脂容易脫附再生。此外，吸附焓變隨著吸附量的增大而減小，這主要是由于D-101樹脂表面的不均勻性所致:在吸附開始時，吸附質會被吸附在樹脂表面上吸附中心最活潑的地方，此時吸附活化能最小，放出的吸附熱最大，隨著吸附量的增加，樹脂內(nèi)部最活潑的活性中心逐步被占據(jù)，吸附質只能吸附在那些較不活潑的吸附中心上，此時吸附活化能增加，使得吸附熱有所減小。

2．4 不同體積分數(shù)的乙醇洗脫液對大孔樹脂解吸率的影響

實驗結果表明，隨乙醇體積分數(shù)的增大，總黃酮解吸率逐漸增加，至乙醇體積分數(shù)為75%時，總黃酮解吸率達到最大，為94．5%;乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大洗脫率反而減小。可見乙醇體積分數(shù)過低或過高都不利于樣品解吸。

2．5 動態(tài)解吸曲線

從圖6可以看出，采用75%的乙醇溶液以2 mL/min的流速進行動態(tài)洗脫，洗脫峰集中，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象。用60 mL的75%乙醇就可以將提取物黃酮基本洗脫下來，此時黃酮收率達94．5%。純化后黃酮純度為84．5%，是粗提液黃酮含量(16．8%)的5倍，說明D-101大孔吸附樹脂能有效地富集純化金銀花葉莖藤浸出液中的總黃酮。

圖6 D-101樹脂解吸曲線Fig.6 Desorption curve

3 結論

用D-101大孔吸附樹脂可有效分離純化金銀花葉莖藤總黃酮，溫度30℃最佳吸附工藝參數(shù)為:黃酮樣液濃度0．538 mg/mL、靜置吸附時間80 min、料液比5∶1、pH 2。最佳解吸附工藝參數(shù)為:流速為2 mL/min下用60 mL 75%的乙醇溶液洗脫黃酮回收率高達94．5%。金銀花葉莖藤粗提液總黃酮得率為1．1%，在最佳吸附及解吸工藝條件下，黃酮純度由純化前的16．8%提高至84．5%，純度提高5倍。

D-101大孔樹脂對金銀花葉莖藤總黃酮的吸附方式是單分子層吸附，很好地符合Langmuir吸附等溫方程式，是自發(fā)性放熱過程。

D-101樹脂吸附金銀花葉莖藤中黃酮的吸附動力學可用Pseudo-second-order模型較好地擬合，其表觀吸附速率常數(shù)為K30℃=1．034×10-2g/mg·min。藥典)．Beijing:Chemical Industry Press，2005．152-153．

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