鄧桂茹，張慶云，李蓉，韓香（武警后勤學(xué)院基礎(chǔ)部化學(xué)教研室，天津 300162）

氨基醇是一種重要的氨基酸衍生物，其可作為非天然氨基酸構(gòu)件對(duì)許多生物活性多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成具有抗酶解的假肽（Pseudopeptide）[1-2]，進(jìn)而發(fā)展成為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的創(chuàng)新藥物。例如，臨床上廣泛應(yīng)用于治療上消化道出血的多肽藥物奧曲肽（Octreotide）就是從天然生長(zhǎng)抑素（Somatostatin）14肽改造而來(lái)，即是將C末端蘇氨酸（Thr）還原成了蘇氨醇（Thr-ol）結(jié)構(gòu)。手性氨基醇及其衍生物不僅可以作為藥物合成中重要的原料和中間體，因其具有良好配位能力的N原子和C原子，還能作為手性助劑用于不對(duì)稱催化反應(yīng)[3-4]，在藥物化學(xué)中廣泛應(yīng)用。目前文獻(xiàn)[5]上報(bào)道制備氨基醇的方法主要是用氨基酸酯的還原，但這種方法對(duì)于含側(cè)鏈羥基的絲氨酸和蘇氨酸還原為絲氨醇和蘇氨醇的效果均不理想，難以分離純化，收率也較低（＜30.3%）。本研究采用側(cè)鏈羥基和氨基均被保護(hù)的蘇氨酸[Boc-Thr（Bzl）-OH]為原料，通過(guò)改變反應(yīng)條件，尋求一條簡(jiǎn)便、高效地合成N-叔丁氧羰基-O-芐基-L-蘇氨醇{[Boc-Thr（Bzl）-ol]，化合物1}的工藝路線，并將其作為原料合成奧曲肽。

1 材料

1.1 儀器

YANACO-S3顯微熔點(diǎn)儀（日本島津公司）；170-SX型傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀（美國(guó)Nicolet公司）；MERCURY-300核磁共振（NMR）儀[美國(guó)Varian公司，內(nèi)標(biāo):四甲基硅烷（TMS）]；Autospec-Ultima ETOF質(zhì)譜（MS）儀（英國(guó)Micromass公司）；Perkin-Elmer 341 LC旋光儀（美國(guó)珀金-埃爾默公司）。

1.2 藥品與試劑

合成使用的叔丁氧羰基（Boc）保護(hù)氨基酸、縮合試劑均從上海吉爾生化有限公司購(gòu)入，氯甲酸乙酯（C2H5OCOCl）、氯甲酸異丁酯、N-甲基嗎啉（NMM）從AlfaAesar（天津）化學(xué)有限公司購(gòu)入，卡特縮合劑（BOP）、四氫鋰鋁（LiAlH4）、硼氫化鈉（NaBH4）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，以上試劑均為分析純；其余溶劑均為市售分析純，經(jīng)重蒸處理；層析硅膠（160～200目）為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以Boc-Thr（Bzl）-OH為原料合成化合物1，反應(yīng)體系分別采用混合酸酐法、LiAlH4法以及BOP法，并比較合成收率及純度。

2.1.1 混合酸酐法合成化合物1。合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 混合酸酐法合成化合物1的路線圖Fig 1 The synthesis scheme of compound 1 by mixed anhydride method

將 Boc-Thr（Bzl）-OH 1.546g（5mmol）溶于 25ml無(wú)水四氫呋喃（THF）中，－10℃冰鹽浴下加入二異丙基乙胺（DIPEA）0.877 ml（5 mmol）及氯甲酸乙酯0.475 ml（5 mmol），攪拌7 min，后加入干燥的NaBH40.565 g（15 mmol），維持0℃，滴加甲醇（MeOH）50 ml，20 min滴加完畢。攪拌15 min，減壓蒸除有機(jī)溶劑，加蒸餾水25 ml，乙酸乙酯（EtOAc）萃取3次，合并乙酸乙酯層，依次用飽和NaHCO3、水、1 mol/L HCl、飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，柱層析分離得到淡黃色透明油狀物1.227 g。經(jīng)薄層色譜（TLC）分析為單一斑點(diǎn)，比移值（Rf）＝0.67[EtOAc-石油醚（PE）（2∶1）]，合成收率:83.2%，光學(xué)純度:99.0%。

合成產(chǎn)物經(jīng)IR表征:3429 cm－1，1105 cm－1，2933 cm－1，2873 cm－1，3018 cm－1，1496 cm－1，1460 cm－1，1442 cm－1，893 cm－1，864 cm－1，1192 cm－1，1635 cm－1。

合成產(chǎn)物經(jīng)1H-NMR（300MHz，CDCl3，δppm，JHz）表征:7.28～7.4（m，5 H，Ar—H），5.1（br，1 H，—NH—），4.63（d，1 H，J＝11.4，—O—CH2—Ar），4.38（d，1 H，J＝11.4，—O—CH2—Ar），3.84（m，1 H，CH3—CH—O—），3.74（m，1 H，—NH—CH—CH2OH），3.648（m，2 H，—CH2OH），1.445（s，9 H，—Boc），1.26（d，3 H，J＝6.3，—CH3）。

合成產(chǎn)物經(jīng)快原子轟擊（FAB）-MS表征:質(zhì)荷比（m/z）為296[M+H]+。

2.1.2 LiAlH4法合成化合物1。合成路線見(jiàn)圖2。

圖2 LiAlH4法合成化合物1的路線圖Fig 2 The synthesis scheme of compound 1by LiAlH4method

稱量LiAlH40.380 g（10.0 mmol）于干燥三口圓底燒瓶中，加入無(wú)水THF 5 ml，油浴80℃加熱回流（回流管上端加干燥管）。將Boc-Thr（Bzl）-OH 0.927g（3.0mmol）溶于少量無(wú)水THF，于恒壓漏斗中緩慢加入反應(yīng)瓶，攪拌回流，1.5 h時(shí)補(bǔ)加LiAlH4，又有氣泡產(chǎn)生，2 h時(shí)反應(yīng)畢。加入10%KOH溶液，加熱回流20min，過(guò)濾，濾餅用THF 20ml洗滌，濾餅中再加入40 ml THF回流20 min，重復(fù)1次，合并濾液及洗液，減壓回收溶劑。剩余物中加入二氯甲烷（DCM）40 ml，攪拌溶解，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，柱層析分離得到淡黃色透明油狀物0.650 g。經(jīng)TLC分析為單一斑點(diǎn)，Rf＝0.65[EtOAc-PE（2∶1）]，合成收率:73.4%，光學(xué)純度:98.8%。IR、1H-NMR表征數(shù)據(jù)與“2.1.1”項(xiàng)下一致。FAB-MS:m/z為296[M+H]+。

2.1.3 BOP法合成化合物1。合成路線見(jiàn)圖3。

圖3 BOP法合成化合物1的路線圖Fig 3 The synthesis scheme of compound 1by BOPmethod

將 Boc-Thr（Bzl）-OH 0.618 g（2 mmol）與 BOP 0.973 g（2.2 mmol）溶于10 ml無(wú)水THF中，加入DIPEA 0.42 ml（2.4 mmol），室溫下攪拌反應(yīng)5min。后加入干燥的NaBH40.228g（6.0 mmol），反應(yīng)20 min后，滴加甲醇50 ml，10 min滴加完畢，攪拌15 min。蒸除有機(jī)溶劑，加蒸餾水100 ml，EtOAc提取3次，合并EtOAc層，依次用1 mol/L HCl、水、飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，柱層析分離得到淡黃色透明油狀物0.410g。經(jīng)TLC分析為單一斑點(diǎn)，Rf＝0.66[EtOAc-PE（2∶1）]，合成收率:69.5%，光學(xué)純度:98.5%。IR、1H-NMR表征數(shù)據(jù)與“2.1.1”項(xiàng)下一致。FAB-MS:m/z為296[M+H]+。

2.2 化合物1的最佳合成路線條件

綜上，與LiAlH4法、BOP法相比，混合酸酐法反應(yīng)迅速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡(jiǎn)便、合成收率高、對(duì)保護(hù)基沒(méi)有影響，因此選用混合酸酐法合成化合物1。最佳工藝條件:將Boc-Thr（Bzl）-OH（20mmol）溶于80ml無(wú)水THF中，冰鹽浴下加入NMM（20 mmol）及氯甲酸異丁酯（20 mmol），攪拌7 min；后加入干燥的 NaBH4（2.28g，60mmol），維持0℃，滴加甲醇200 ml，30min滴加完畢，攪拌15min；蒸除有機(jī)溶劑，加蒸餾水200 ml，EtOAc提取3次，合并EtOAc層，依次用飽和NaHCO3、水、1 mol/L HCl、飽和NaCl水充分洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，柱層析分離得到無(wú)色透明油狀物5.335 g。經(jīng)TLC分析為單一斑點(diǎn)，Rf＝0.67[EtOAc-PE（2∶1）]，合成收率:90.4%，光學(xué)純度:99.2%。IR、1H-NMR表征數(shù)據(jù)與“2.1.1”項(xiàng)下一致。FAB-MS:m/z為296[M+H]+。

2.3 化合物1在奧曲肽合成中的應(yīng)用

2.3.1 O-芐基蘇氨醇鹽酸鹽[HCl·Thr（Bzl）-ol]（化合物2）的合成。合成路線見(jiàn)圖4。

圖4 化合物2的合成路線圖Fig 4 The synthesis scheme of compound 2

將2.977g（10.1mmol）化合物1，在0℃冰水浴及攪拌下加入飽和HCl/EtOAc約40ml，固體全溶。待析出白色固體，10min后撤去冰水浴，室溫反應(yīng)進(jìn)行至TLC檢測(cè)原料消失。減壓蒸除溶劑，無(wú)水乙醚（Et2O）、EtOAc充分研磨、洗滌，得到白色固體，收率:98.7%，熔點(diǎn):109～110℃，[α]D20＝－5.7°（c 1.24，乙醇）。FAB-MS:m/z為196.2[M+H]+。

2.3.2 奧曲肽的全合成。奧曲肽的全合成設(shè)計(jì)采用（7+1）的固相方法:先合成7肽-樹(shù)脂（化合物3），然后用蘇氨醇氨解法裂解肽樹(shù)脂，并形成側(cè)鏈保護(hù)的八肽醇（化合物4），合成路線見(jiàn)圖5。

圖5 奧曲肽的合成路線圖Fig 5 The synthesis scheme of octreotide

將合成的中間體樹(shù)脂化合物3約1.88 mg（0.71 mmol），置于100 ml圓底燒瓶中，加入已溶于16 ml THF-DMF（2∶1）中的化合物 2約 2.05g（8.87mmol）及三乙胺（TEA）1.25ml（9 mmol）溶液，于55℃下攪拌32 h。反應(yīng)畢將全部混懸液經(jīng)G3號(hào)砂板漏斗抽濾，收集濾液。殘余樹(shù)脂用THF及MeOH交替洗濾。洗出液與第1次濾液合并，再于50℃下減壓濃縮，除去大部分溶劑。向殘留液中加0.5 mol/L HCl溶液50 ml，充分?jǐn)嚢? h，濾集白色沉淀，水洗沉淀，抽干。濾出的水溶液經(jīng)中和、提取，可回收化合物2。將灰色膏狀產(chǎn)物化合物4的粗品放入含粒狀NaOH的真空干燥器中，抽真空過(guò)夜。自干燥器中取出化合物4的粗產(chǎn)物，溶于5 ml無(wú)水乙醇后逐漸加入10 ml EtOAc，出現(xiàn)渾濁。放冰箱（－18℃左右）過(guò)夜后過(guò)濾，得白色粉末362 mg。氨解及重結(jié)晶的合計(jì)收率為30.9%。經(jīng)TLC分析為單一斑點(diǎn)，Rf＝0.41[EtOAc-PE（4∶1）]?；衔?經(jīng)脫保護(hù)、氧化環(huán)合、反相-高效液相色譜法純化后得奧曲肽純品（鑒定等另文發(fā)表），總收率6%，純度＞98%，表明收率明顯比文獻(xiàn)[5]收率2.7%高。

3 討論

目前，手性氨基醇主要有以下幾種合成方法:氨基酸（醛、酮）的還原或加成；氨基酸酯的還原；環(huán)氧乙烷類(lèi)疊氮化還原。在以上合成方法中，最直接的方法是以天然手性化合物氨基酸為原料，通過(guò)直接還原或親核加成反應(yīng)獲得相應(yīng)的手性氨基醇。在諸多的天然氨基酸中，基于L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸等的研究較多，但L-蘇氨酸衍生的手性氨基醇的合成及其應(yīng)用方面的報(bào)道不多。本研究采用側(cè)鏈羥基和氨基均受保護(hù)的蘇氨酸為原料，通過(guò)改變還原劑、反應(yīng)系統(tǒng)等條件，建立一條高效、廉價(jià)且操作簡(jiǎn)便的工藝路線制備化合物1，并在多肽藥物奧曲肽的合成中成功應(yīng)用。

由相應(yīng)的氨基酸還原得到氨基醇，還原劑主要有LiAlH4、甲硼烷（BH3）、NaBH4、二異丁基氫化鋁（DIBAL-H）等，對(duì)產(chǎn)物為脂溶性的氨基醇還原收率很高，但對(duì)水溶性的氨基醇產(chǎn)物，如蘇氨醇和絲氨醇，則分離困難、收率低。主要原因是蘇氨醇、絲氨醇分子中有2個(gè)側(cè)鏈羥基，在水中溶解度較大，反應(yīng)完畢后產(chǎn)物與無(wú)機(jī)鹽混在一起，難以純化。N-保護(hù)的氨基醇是一類(lèi)重要的化合物，其在藥物及天然產(chǎn)物合成中是重要的中間體，可以用來(lái)合成具有生物活性的氨基醛、肽醛和肽醇等。如何采用價(jià)廉易得的原料，得到相應(yīng)的氨基醇，建立反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、化學(xué)選擇性好、保護(hù)基不受影響的合成工藝具有廣泛意義。本研究通過(guò)3種合成方法比較，確定了混合酸酐法合成Boc全保護(hù)氨基醇以后，又對(duì)其工藝進(jìn)行了優(yōu)化?？紤]用NMM代替DIPEA，由于NMM的空間位阻小、堿性弱、消旋小、混合酸酐的收率高，可將縮合率由83.2%提高到90.4%。何洪華等[6]以側(cè)鏈不保護(hù)的芴甲氧羰基（Fmoc）-蘇氨酸與NMM和氯甲酸異丁酯反應(yīng)后經(jīng)NaBH4還原、脫除Fmoc保護(hù)基得到蘇氨醇，總收率83%。孫濱源等[7]以側(cè)鏈不保護(hù)的Boc-蘇氨酸與N-乙基嗎啉和氯甲酸異丁酯反應(yīng)后經(jīng)NaBH4還原、脫除Boc保護(hù)基得到蘇氨醇，總收率為64.7%。本研究采用氨基酸的混合酸酐法進(jìn)行還原制備氨基醇時(shí)，根據(jù)合成需要將側(cè)鏈羥基也進(jìn)行了保護(hù)，脫除Boc保護(hù)基后總合成收率為89.2%。

氨基醇除了作為不對(duì)稱金屬催化的手性配體在手性合成中有廣泛用途外，也是核苷酸類(lèi)藥物的原料，用于合成修飾寡核苷酸、脂肪族核苷或核苷類(lèi)似物等[8]。在肽類(lèi)藥物的研發(fā)中，氨基醇及其衍生物同樣起到了重要作用。肽類(lèi)化合物半衰期短、生物利用率低，因此許多科學(xué)家致力于活性肽類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)改造，以期將其發(fā)展成為理想的藥物。多肽分子中只要選擇適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)修飾改造，其整個(gè)分子即可獲得對(duì)抗酶降解的能力，同時(shí)保留期望的活性。其中，以非天然氨基酸組分代替一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸組分，例如用氨基醇替換相應(yīng)的氨基酸而制得非經(jīng)典肽是改造活性肽中一種非常重要和有效的手段。為了考察合成的保護(hù)氨基醇在肽縮合反應(yīng)中的性能，本文設(shè)計(jì)采用了（7+1）的固相方法，用蘇氨醇氨解法裂解并成功合成了奧曲肽，為開(kāi)發(fā)有臨床應(yīng)用價(jià)值的多肽藥物提供可靠依據(jù)。

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