王子竹，安鐵洙，李昊，樸善花，王春生

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

綿羊c-Myc的克隆與序列分析

王子竹，安鐵洙，李昊，樸善花，王春生

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

參照GenBank上綿羊c-Myc序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)從60d左右胎羊生殖嵴總RNA中擴(kuò)增得到綿羊c-Myc基因編碼區(qū)序列，其為包括終止密碼子在內(nèi)的1320 bp，編碼有439個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示，綿羊c-Myc基因編碼區(qū)與牛、豬、貓、人、大鼠、小鼠、雞、爪蟾和斑馬魚的核苷酸序列同源性分別為98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%和63.9%，其氨基酸序列同源性分別為98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%和64.6%；生物信息學(xué)軟件分析顯示，綿羊c-Myc含有細(xì)胞核定位模體和HLH結(jié)構(gòu)域。本研究為進(jìn)一步研究c-Myc基因的功能及探討其中綿羊體細(xì)胞重編程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

綿羊；c-Myc；序列分析

自Takahashi[1]等（2006）首次利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞為多能干細(xì)胞（induction pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞）以來(lái)，采用上述相同或相近的方法，已相繼誘導(dǎo)大鼠、猴、人、豬、兔等體細(xì)胞獲得iPS[2-7]。上述結(jié)果顯示，c-Myc在誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞為iPS過程中發(fā)揮重要作用。目前，與其他動(dòng)物的c-Myc因子相比，尚未見到有關(guān)綿羊c-Myc的相關(guān)報(bào)道。本研究利用胎羊生殖嵴組織提取總RNA，并擴(kuò)增獲得綿羊c-Myc基因編碼區(qū)序列，在此基礎(chǔ)上，與其他物種的c-Myc比較并預(yù)測(cè)了其所表達(dá)的蛋白特點(diǎn)，為進(jìn)一步探明綿羊c-Myc基因的功能和建立完善的綿羊iPS方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、載體及菌株

rTaq DNA聚合酶、BamHI、HindIII、T4連接酶、Oligo15引物、pMD18-T載體及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）；Trizol（Invitrogen）；質(zhì)粒小提小量試劑盒和膠回收試劑盒（Omega）；Trans5α感受態(tài)細(xì)胞（TransGen）。

1.2 胎綿羊生殖嵴總RNA提取

選擇性成熟的東北半細(xì)毛羊進(jìn)行自然交配，在母羊懷孕后的第60 d，處死并采集子宮內(nèi)的胎兒。采集胎羊生殖嵴組織50 mg，采用Trizol法提取總RNA，并置于-80℃冰箱保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中綿羊的c-Myc基因mRNA序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增包括編碼區(qū)在內(nèi)約1 400 bp序列。引物由寶生物公司合成，序列如下：

1.4 cDNA的獲得

在含有1 μg總RNA和1 μL Oligo15（50 μM）的0.2 mL的EP管中，添加3 uL DEPC滅菌水，在70℃下保持10 min后冰浴2 min，再依次加入5x M-MLV Buffer 2 μL、dNTP（10 mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RTase M-MLV 0.5 μL和DEPC滅菌水0.75 μL，置于42°C保持1 h，70°C保溫15 min，冰浴數(shù)分鐘，以獲得cDNA。

1.5 c-Myc基因編碼區(qū)的克隆與測(cè)序

以上述cDNA為模板，以Sc-Myc-1和Sc-Myc-2為引物對(duì)Klf4基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中cDNA 1μL，dNTP（2.5 mM）4 μL，rTaq Buffer（10x）2.5 μL，引物Sc-Myc-1和Sc-Myc-2各1 μL，rTaq酶0.3 μL。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，58°C退火45 s，72°C延伸45 min，30個(gè)循環(huán)，結(jié)束循環(huán)后72°C再延伸7 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳回收后，與pMD18-T載體室溫連接5 min（PCR回收產(chǎn)物7.5 μL，pMD-18載體1 μL，T4連接酶0.5 μL，T4 buffer 1 μL），取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL Trans5α型感受態(tài)細(xì)胞，Amp抗性及藍(lán)白斑篩選。挑取白色克隆于含有Amp的LB培養(yǎng)基中搖菌，小提小量試劑盒提取質(zhì)粒。

以Sc-Myc-1和Sc-Myc-2為引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定；用BamHI和HindIII對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。取PCR及酶切鑒定均正確的c-Myc-pMD18重組質(zhì)粒送Invitrogen公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

用NCBI blastn程序和DNAMAN軟件分別進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)，在NCBI站點(diǎn)上利用ORF finder分析軟件識(shí)別開放閱讀框(ORF)。采用DNAMAN5.2軟件比對(duì)高同源蛋白的氨基酸序列并構(gòu)建進(jìn)化樹。利用PlantsP(http://plantsp.genomics.purdue.edu/html/)和ScanProsite軟件(http://us.expasy.org/ prosite/)分析蛋白功能結(jié)構(gòu)域。用Psort軟件(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)分析c-Myc蛋白的亞細(xì)胞定位。查找推測(cè)的氨基酸序列是否具有鋅指結(jié)構(gòu)序列。

2 結(jié)果

2.1 綿羊c-Myc基因編碼區(qū)的RT-PCR擴(kuò)增

利用Sc-Myc-1和Sc-Myc-2引物對(duì)獲得的胎綿羊生殖嵴組織cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果在紫外燈下可見約1 400 bp的目的條帶(圖1)。

將上述RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，獲得重組質(zhì)粒c-Myc-pMD18。將重組質(zhì)粒用BamHI和HindIII雙酶切，獲得與預(yù)期結(jié)果一致的約為1 400 bp和小于3000 bp的兩個(gè)片段(見圖2)。并且，以重組質(zhì)粒c-Myc-pMD18為模板，用PCR方法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，可得到一條約為1400 bp的核酸片段，顯示目的基因已克隆到pMD18-T載體中(如圖3)。

圖1 RT-PCR結(jié)果

圖2 c-Myc-pMD18質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖3 c-Myc-pMD18質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 c-Myc基因編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列分析

將c-Myc-pMD18重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序后，經(jīng)生物軟件分析表明綿羊c-Myc基因編碼區(qū)序列為包括終止密碼子在內(nèi)的1320bp，編碼419個(gè)氨基酸。

利用BioEdit軟件將綿羊c-Myc序列與GenBank中牛c-Myc的參照序列（NM_001046074）進(jìn)行比對(duì)，其結(jié)果，其同源性為98.0%，二者存在27處差異。c-Myc基因編碼區(qū)序列同牛、豬、貓、人、大鼠、小鼠、雞、爪蟾和斑馬魚的核苷酸序列同源性分別為98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%和63.9%，見圖4。

圖4 綿羊與各物種c-Myc核苷酸序列序列同源性分析

利用DNAStar軟件繪制不同物種c-Myc編碼區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，其結(jié)果，綿羊與牛親緣關(guān)系最近，遺傳距離最小；而與豬、貓、人、大鼠、小鼠、雞、爪蟾和斑馬魚親緣關(guān)系依次變遠(yuǎn)，與傳統(tǒng)分類學(xué)基本相符，見圖5。

圖5 十個(gè)物種c-Myc編碼區(qū)核苷酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

將綿羊c-Myc蛋白與從Genbank上下載的鼠、牛和豬等物種的c-Myc蛋白進(jìn)行比對(duì)。其結(jié)果表明綿羊c-Myc蛋白同牛、豬、貓、人、大鼠、小鼠、雞、爪蟾和斑馬魚的c-Myc氨基酸的同源性分別為98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%和64.6%，見圖6。

圖6 綿羊與各物種c-Myc氨基酸序列同源性分析

2.3 綿羊c-Myc蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能域分析

利用PSORT Prediction（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）對(duì)推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析，其結(jié)果，c-Myc定位在細(xì)胞核的概率為94.1%，表明最有可能定位在細(xì)胞核內(nèi)，見圖7。

圖7 綿羊c-Myc蛋白質(zhì)功能域預(yù)測(cè)

根據(jù)c-Myc氨基酸序列的查詢，綿羊c-Myc編碼的蛋白含有在354-406位氨基酸（DKRRThNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPElENNEKAPKVVIL KKATAYILSVQ）含有一個(gè)HLH特異結(jié)構(gòu)域（圖7）。

3 討論

已有大量的研究證實(shí)，c-myc在誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞為iPS過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)Yano等[8]（1993）報(bào)道，c-Myc基因既是一種致癌基因，又是一種轉(zhuǎn)錄因子，其在正常細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過程發(fā)揮作用，但是，如果c-Myc基因過高表達(dá)可往往誘發(fā)人類癌癥疾病。此外，現(xiàn)已證實(shí)[9]，c-Myc基因中存在有調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵區(qū)域，通過該區(qū)域的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)或細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，c-Myc可能與其他相關(guān)誘導(dǎo)因子發(fā)揮協(xié)同作用，通過其調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵區(qū)域，阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞分化的功能。

與其他動(dòng)物相比，有關(guān)綿羊iPS誘導(dǎo)因子的相關(guān)研究相對(duì)滯后，僅有極少的綿羊Klf4基因[10]和Sox2基因[11]的相關(guān)文獻(xiàn)，且尚未見有利用綿羊內(nèi)源性誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)綿羊iPS獲得成功的報(bào)道。為了建立完善的綿羊iPS誘導(dǎo)方法及其機(jī)制，本研究在克隆獲得綿羊c-Myc基因的編碼序列的基礎(chǔ)上對(duì)其序列進(jìn)行了分析。其結(jié)果，綿羊c-Myc基因編碼區(qū)序列，其為包括終止密碼子在內(nèi)的1320bp，編碼有439個(gè)氨基酸，與牛、豬、貓、人、大鼠、小鼠、雞、爪蟾和斑馬魚等物種c-Myc基因具有63.9%以上的同源性，其中與牛同源性最為接近，達(dá)98.0%（圖4）。與此同時(shí)，綿羊c-Myc蛋白氨基酸序列與上述各種動(dòng)物的同源性達(dá)到64.6%以上，其同樣與牛c-Myc蛋白的具有最高同源性，達(dá)到98.0%（圖6）。分子進(jìn)化樹分析也表明，綿羊與牛親緣關(guān)系最近，遺傳距離最?。欢c豬、貓、人、大鼠等親緣關(guān)系依次變遠(yuǎn)，與傳統(tǒng)分類學(xué)基本相符（參見圖5）。上述結(jié)果表明，已成功克隆獲得綿羊c-Myc基因的編碼序列，能否利用其建立完善的綿羊iPS方法有待于進(jìn)一步探討。

據(jù)Berns等[12]的研究表明，c-Myc基因由3個(gè)外顯子及2個(gè)內(nèi)含子組成，其中第一個(gè)外顯子序列與動(dòng)物不同具有較大的差異，且只具有調(diào)控作用，而第二和第三外顯子為編碼蛋白質(zhì)序列且具有高度保守性。本研究序列比較結(jié)果顯示，綿羊c-Myc基因具有相似的特性。迄今尚未見到有關(guān)綿羊c-Myc基因編碼蛋白的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)c-Myc基因的推測(cè)結(jié)果顯示，c-Myc蛋白含有細(xì)胞核定位模體，在第354-406位氨基酸含有HLH結(jié)構(gòu)（圖7）。有關(guān)c-Myc蛋白在綿羊iPS誘導(dǎo)過程中作用機(jī)制有待于探討。

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[2]Takashi K,Tanabe K,Qhnuki M,et al.Induction of pluipotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factor[J].Cell,2007,（131）:1-12.

[3]Lui H,Zhu F,Yong J,et al.Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts[J].Cell stem cell,2008，(3):6587-6590.

[4]Liao J,Cui C,Chen S Y,et al.Generation of induced pluripotent stem cells lines from adult rat cells[J].Cell Stem Cell,2009，(4):11-15.

[5]Esteban M,Xu J,Yang J,et al.Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig[J]. J Biol Chem,2009,284(26):17634-17640.

[6]Honda A,Hirose M,Hatori M,et al.Generation of induced pluripotent stem cells in rabbits-potential experimenyal modela for human regenerative medicine[J].J Biol Chem,2010,（285）:31362-31369.

[7]Bao L,He L,Chen J,et al.Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug inducible expression of defined factor[J].Cell Res,2011,（21）:600-608.

[8]Yano T.,Sander C.A.,Clark H.M.et al.Clustered mutations in the second exon of the Myc gene in sporadic Burkitt’s lymphoma[J].Oncogene,1993,8(10):2741-2748.

[9]Wade M,Wahl G.M.c-Myc,Genome Instability,and Tumorigenesis:The Devil Is in the Details[J].CTMI, 2006,（302）:169-203.

[10]王春生，楊越飛，寧方勇，等.綿羊Klf4基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建與檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011，31 (8):1118-1122.

[11]趙健靈，安鐵洙，張志人，等.綿羊Sox2基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建與檢測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012,39 (5):217-220.

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Cloning and Coding Sequence Analysis of Sheep c-Myc Gene

WANG Zhi-zhu,AN Tie-zhu,LI Hao,PIAO Shan-hua,WANG Chun-sheng
（College of Life Science,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China）

The c-Myc gene was amplified from E60 sheep genital ridge mRNA,and ligated with linear vector pMD-18T.The sequencing results of sheep c-Myc gene(already been logged in GenBank,indicated that it's CDS,including stop coden,was in a length of 1320bp,encoding 439 amino acids,and contained nuclear localization motifs and HLH domain showed by bio-software analysisng.Sheep c-Myc gene also shared 98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%and 63.9%nucleotide homology and 98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%and 64.6%amino acid identity with Bos taurus,Sus scrofa,Felis catus,Homo sapiens,Rattus norvegicus,Mus musculus,Gallus gallus,Xenopus laevis and Danio rerio respectively.The successful cloning of c-Myc shows that the gene in the structure and function is very conservative and helpful to study gene function and role in somatic reprogramming in future.

sheep;c-Myc;sequence analysis.

S814.8

A

1003－6377（2013）01－0024-05

2012-11-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31000990）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(DL10BA06)

王子竹（1987-），女，遼寧人，碩士研究生。

王春生（1979-），男，博士，副教授，研究方向：體細(xì)胞重編程。E-mail：wangchunsheng79@163.com