馬雙雙，齊 陽，王 瑩，徐紀(jì)平，蔡東聯(lián)，黃 文，李兆申

充足的睡眠是維持人體健康和保持學(xué)習(xí)工作效率的前提，隨著社會的發(fā)展和社會競爭壓力的增加，人們的睡眠時間和質(zhì)量普遍下降。近年來針對遠(yuǎn)航官兵心理和生理的研究[1-2］表明，遠(yuǎn)航不僅將對我軍發(fā)展提出深刻挑戰(zhàn)，同時對軍事醫(yī)學(xué)研究提出了新的課題。為探討長距離航行和連續(xù)作戰(zhàn)對官兵身心的危害，本研究擬利用連續(xù)72 h睡眠剝奪大鼠模型，觀察并探討連續(xù)睡眠剝奪對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、腦干中單胺類遞質(zhì)的含量、海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)遞質(zhì)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)受體 mRNA表達(dá)及海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF級雄性大鼠20只，購自上海西普爾-必凱實驗動物研究所，體質(zhì)量150～160 g。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后放入Y迷宮刺激器，淘汰對電擊不敏感者及異常遲鈍者，剩余12只大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為正常睡眠對照組(對照組)和睡眠剝奪組，每組6只。

1.2 試劑與儀器 去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(adrenalin，AD)、多巴胺(dopamine，DA)三聯(lián)試劑盒和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)試劑盒均為德國LDN公司產(chǎn)品;Trizol購自Invitrogen公司，RT-PCR M-MLV試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，SYBR Green試劑盒(ABI);引物由Invitrogen合成;Real Time PCR反應(yīng)體系由Transhold公司提供;連續(xù)V型食槽式動物睡眠剝奪箱由海軍醫(yī)學(xué)研究所研制并提供;H-7650分析透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品;Y型迷宮刺激器由安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3 迷宮訓(xùn)練 Y迷宮三臂等長，分別命名為I區(qū)、II區(qū)、III區(qū)，臂間夾角為 120°，迷宮底部鋪銅棒電網(wǎng)。當(dāng)I、II、III任一區(qū)域指示燈亮?xí)r，亮燈的區(qū)域為安全區(qū)，供大鼠逃避;其余區(qū)域銅棒通電，為刺激區(qū)。每周對各組大鼠進(jìn)行3天迷宮訓(xùn)練，每只每天訓(xùn)練10次。

1.4 連續(xù)睡眠剝奪 對照組大鼠放置于有大圓形平臺(直徑20 cm)的模擬睡眠剝奪箱里，大鼠可以在平臺上正常睡眠;睡眠剝奪組大鼠放置于有小圓形平臺(直徑6 cm)的睡眠剝奪箱，每個睡眠剝奪箱內(nèi)有8個小平臺，為了讓大鼠有空間移動，睡眠剝奪箱內(nèi)放6只大鼠。睡眠剝奪組大鼠進(jìn)行連續(xù)72 h睡眠剝奪。所有大鼠均可以自由進(jìn)食和飲水，每日

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，組間比較進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 迷宮反應(yīng)正確率 2組大鼠在睡眠剝奪前的迷宮反應(yīng)率分別為89%和90%，差異無統(tǒng)計學(xué)意更換箱中水環(huán)境，保持箱內(nèi)清潔。

1.5 記憶行為學(xué)檢測 在72 h睡眠剝奪后，對2組大鼠進(jìn)行記憶能力檢測。將各組大鼠分別放到Y(jié)迷宮中，開啟安全區(qū)和刺激區(qū)，大鼠能在5 s內(nèi)迅速反應(yīng)到達(dá)安全區(qū)并停留20 s為1次正確反應(yīng)，規(guī)定時間內(nèi)沒能到達(dá)安全區(qū)或者沒能在安全區(qū)停留20 s則為錯誤反應(yīng)，由2名研究員同時目測判斷。每只大鼠進(jìn)行10次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)。

1.6 標(biāo)本采集 迷宮測試后，用10%水合氯醛將大鼠麻醉，處死后快速在冰袋上分離腦干和海馬，先放入液氮罐中后移至－80℃冰箱中保存待測。

1.7 腦干神經(jīng)遞質(zhì)檢測 將冷凍腦干組織研磨、勻漿后，按試劑盒說明測定NE、AD和DA的含量;按5-HT試劑盒的說明檢測5-HT含量。

1.8 NR1/NR2A mRNA 和 GABAARα1 mRNA 的PCR檢測 通過實時熒光定量PCR技術(shù)測定NMDA受體亞單位NR1/NR2A mRNA以及GABA受體GABAARα1 mRNA的表達(dá)水平。操作步驟如下:選取2組大鼠海馬區(qū)腦組織，于液氮中迅速研磨，用Trizol抽提海馬總RNA，并按M-MLV試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR引物分別為:NR1 mRNA(103 bp);上游引物5'-AGTGGGCATCTACAATGGT3'，下游引物5'-TCTGGTGGACATCTGGTATC-3';NR2A mRNA(132 bp)上游引物5'-GTCGGAAGTTCGTCAAGAT-3'，下 游引 物 5'-CCAGGTAGAGGTCATAGGTG-3';GABAARα1 mRNA(136 bp)上游引物 5'-AAGCCCGTGATGAAGAAAAG-3'，下 游 引 物 5'-TCGTGAAGACAGTGGTGTTG-3';內(nèi)參 ratβ-actin(155 bp)上游引物5'-CCTCTATGCCAACACAGT-3'，下游引物5'-AGCCACCAATCCACACAG-3'。PCR擴(kuò)增按 SYBR Green試劑盒說明進(jìn)行，反應(yīng)體系為20μl。擴(kuò)增條件:95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 30 s→溶解曲線分析，共40個循環(huán)。

1.9 海馬區(qū)組織電鏡觀察 根據(jù)大鼠腦立體定位圖定位右側(cè)海馬區(qū)取材，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，樹脂包埋，超薄切片，染片，透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。義;72 h睡眠剝奪后，對照組正確率為91%，睡眠剝奪組為54%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 大鼠腦干單胺類遞質(zhì)比較 2組大鼠腦干中NE、AD、DA和5-HT含量見表1。由表1可以看出，對照組NE、AD、DA明顯高于睡眠剝奪組(P＜0.05);對照組5-HT顯著低于睡眠剝奪組(P＜0.05)。

表1 2組大鼠腦干中單胺類遞質(zhì)含量的比較(±s，各組 n=6)

表1 2組大鼠腦干中單胺類遞質(zhì)含量的比較(±s，各組 n=6)

注:與對照組比較a P＜0.05;AD、NE、DA、5-HT分別為腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺

組別 AD(ng/g) NE(ng/g) DA(ng/g) 5-HT(mg/L)對照組 1.351±0.228 33.944±8.140 4.801±0.635 6.685±1.191睡眠剝奪組 0.896±0.178a 22.424±4.487a 3.778±0.419a 9.727±1.853a

2.3 腦干組織幾種物質(zhì)mRNA的PCR結(jié)果 睡眠剝奪組NR1mRNA和NR2AmRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組(P＜0.05)，睡眠剝奪組的GABAARα1mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05)。見表2。

表2 2組大鼠海馬組織中GABAARα1、NR1、NR2A m RNA表達(dá)情況(±s，各組 n=6)

表2 2組大鼠海馬組織中GABAARα1、NR1、NR2A m RNA表達(dá)情況(±s，各組 n=6)

注:與對照組比較a P＜0.05;GABA為γ-氨基丁酸

1mRNA NR1mRNA NR2AmRNA對照組 (0.581±0.086)×10－3(9.885±1.833)×10 －3(2.616±0.453)×10組別 GABAARα－3睡眠剝奪組 (0.794±0.144)×10－3a(4.999±1.077)×10 －3a(1.256±0.261)×10－3a

2.4 海馬區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞器完整，線粒體清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均勻分布，未見空泡樣變;睡眠剝奪組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體高度腫脹、可見明顯的脫顆粒、嵴斷裂和溶解現(xiàn)象。見圖1。

圖1 2組大鼠海馬神經(jīng)元電鏡觀察結(jié)果(×10 000)

3 討論

大量的研究表明，谷氨酸對學(xué)習(xí)記憶起正調(diào)節(jié)作用，GABA對學(xué)習(xí)記憶起負(fù)調(diào)節(jié)作用[3］。在睡眠剝奪過程中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸大量釋放，產(chǎn)生了神經(jīng)毒性作用，造成神經(jīng)元急性水腫，神經(jīng)元變性壞死，導(dǎo)致NMDA受體mRNA的下調(diào)[4］。GABA是由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧而成。大量的谷氨酸堆積時，谷氨酸脫羧酶活性增強(qiáng)，將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA以減輕神經(jīng)毒性作用，GABA的合成增多激活了GABA受體，GABA受體mRNA表達(dá)增加[4］。本實驗中，大鼠海馬里降低的NMDA受體和升高的GABA受體可能是大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的一個重要因素。

此外，長時間睡眠剝奪后，腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)發(fā)生改變。睡眠剝奪后，突觸前膜5-HT受體敏感性下降，對5-HT的再攝取減少，同時5-HT合成增加，機(jī)體內(nèi)5-HT水平增高，出現(xiàn)疲勞感和睡意。鄭樂穎等[5］研究發(fā)現(xiàn)，在睡眠剝奪前期，機(jī)體能通過增加單胺氧化酶活性加快5-HT轉(zhuǎn)化為5-羥吲哚乙酸，以減少5-HT在腦內(nèi)的積累，達(dá)到維持清醒的目的。但是，隨著睡眠剝奪時間的延長，單胺氧化酶的活性降低，轉(zhuǎn)化作用減弱，5-HT在腦干、下丘腦等蓄積，機(jī)體產(chǎn)生更加嚴(yán)重的疲勞感[6］。在本實驗中，經(jīng)過72 h睡眠剝奪的大鼠腦干中5-HT含量顯著升高，可能是由于單胺氧化酶的活性低，導(dǎo)致5-HT的集聚。

DA是哺乳動物大腦中主要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，占腦內(nèi)所有兒茶酚胺類遞質(zhì)含量的80%。DA對神經(jīng)系統(tǒng)有興奮作用，隨著睡眠剝奪的進(jìn)行，中樞疲勞的出現(xiàn)，中樞中DA含量逐漸減少。研究表明，被剝奪快眼睡眠的動物前額皮質(zhì)中DA含量下降而NE水平升高[7-8］。本實驗中，睡眠剝奪后的大鼠腦干中DA下降，可能是其認(rèn)知功能下降的重要因素。

NE能改善神經(jīng)元細(xì)胞的可塑性，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶，與中樞學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切。Basheer等[9］研究證明，NE系統(tǒng)活動有利于信息的鞏固和再現(xiàn)，NE活性降低能引起與年齡有關(guān)的記憶障礙。Mallick等[10］研究發(fā)現(xiàn)，短時間的睡眠剝奪(＜2 d)會造成大鼠海馬NE濃度明顯升高，而在長時間的睡眠剝奪后，大鼠海馬NE含量下降。其可能原因是短時間的睡眠剝奪造成應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致NE合成和釋放增加，而再攝取受到抑制，NE的釋放速率大于再攝取速率，造成NE在海馬內(nèi)蓄積。長時間睡眠剝奪后，大量蓄積的NE致使神經(jīng)元損傷，致使機(jī)體大量降解蓄積的NE，同時長時間的睡眠剝奪致使大量能量的消耗，NE合成速率明顯降低，導(dǎo)致腦內(nèi)NE含量下降，學(xué)習(xí)能力降低。本實驗中，睡眠剝奪后大鼠的NE含量下降，可能與神經(jīng)元損失后機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)。

[1] 何俐勇，許輝，樊龍中，等.長航對艦艇官兵血液流變學(xué)和凝血功能的影響[J］.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2012，19(4):237-238.

[2] 林萃靈，樊龍中，陳正，等.艦艇官兵長時間遠(yuǎn)洋護(hù)航血清生化指標(biāo)變化研究[J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2011，25(5):421-423.

[3] Kluda A，Martinac B，Adams DJ.Polymodal regulation of NMDA receptor channels[J］.Channels(Austin)，2007，1(5):334-343.

[4] 張蓉，李峰，李維，等.中藥對疲勞大鼠腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)遞質(zhì)谷氨酸及γ-氨基丁酸受體mRNA表達(dá)的影響[J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(8):39-41.

[5] 鄭樂穎，季紅光，王海明，等.睡眠剝奪對大鼠腦5-羥色胺代謝及行為的影響[J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，1998，7(4):256-257.

[6] Thakkar M，Mallick BN.Effect of rapid eyemovement sleep deprivation on rat brain monoamine oxidascs[J］.Neurosci，1993，55(3):677-681.

[7] Niijima F，Saito H，Murai S，et al.Effects of atomoxetine on levels ofmonoamines and related substances in discrete brain regions in mice intermittently deprived of rapid eyemovement sleep[J］.Biol Pharm Bull，2010，33(4):617-621.

[8] Cirelli C.How sleep deprivation affects gene expression in the brain:a review of recent findings[J］.J Appl Physiol，2002，92(1):394-400.

[9] Basheer R，Magner M，McCarley RW，et al.REM sleep deprivation increases the levels of tyrosine hydroxylase and norepinephrine transportermRNA in the locus coeruleus[J］.Brain Res Mol Brain Res，1998，57(2):235-240.

[10]Mallick BN，Singh S，Singh A.Mechanism of noradrenaline-induced stimulation of Na-K ATPase activity in the rat brain:implications on REM sleep deprivationinduced increase in brain excitability[J］.Mol Cell Biochem，2010，336(1-2):3-16.