任曉敏，劉蘋,

1 上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海市，200240

2 上海交通大學(xué)Med-X研究院，上海市，200030

0 引言

腫瘤是發(fā)病率、致死率最高的常見病、多發(fā)病之一[2]。目前腫瘤治療如手術(shù)、放療和化療，效果還不理想，且副作用很大[3-5]。特別對(duì)于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤，幾乎沒有有效的治療方法。由于惡性腫瘤血管異常增生，與正常血管相比，管壁薄弱、分化程度低，缺乏平滑肌及完整的基底膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞之間存在較大縫隙，通透性強(qiáng)，更有利于腫瘤細(xì)胞穿透血管壁形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶[6-7]。針對(duì)目前腫瘤治療現(xiàn)狀，迫切需要尋求新型的腫瘤治療方法。

大多數(shù)惡性腫瘤都會(huì)引起不同程度的免疫抑制，以利于腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和攻擊, 促進(jìn)腫瘤發(fā)展[8-9]。髓源性免疫抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）高表達(dá)髓系分化抗原GR1和CD11b（GR1+CD11b+細(xì)胞），在荷瘤鼠和腫瘤病人中大量增加，引起機(jī)體的免疫抑制。MDSCs參與腫瘤免疫逃逸的方式可概括為兩個(gè)方面，一方面MDSCs可以表達(dá)多種促血管形成因子直接促進(jìn)腫瘤血管的形成。MDSCs細(xì)胞的浸潤(rùn)介導(dǎo)了腫瘤對(duì)抗血管生成治療產(chǎn)生不應(yīng)性，使得抗血管生成療法的失效[10]。另一方面MDSCs可以通過表達(dá)高水平的ARG1、iNOS和ROS來抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)產(chǎn)生及抑制NK和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的天然抗腫瘤免疫[11]。MDSCs已被認(rèn)為是引起腫瘤動(dòng)物試驗(yàn)及臨床病人免疫治療失敗的主要因素。中華醫(yī)學(xué)提示我們，“藥要向內(nèi)求”。疾病治愈的根本應(yīng)該在于機(jī)體系統(tǒng)對(duì)于外界干預(yù)的應(yīng)答能力。所以腫瘤治療的新思路應(yīng)該是局部治療的同時(shí)，是否最大程度的解除機(jī)體免疫抑制狀態(tài)。

熱物理治療是通過外界能量介入體內(nèi)破壞腫瘤的治療方法。與傳統(tǒng)治療方法相比較，它通過短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)極高溫或極低溫達(dá)到破壞腫瘤組織，具有微創(chuàng)性和副作用小等優(yōu)勢(shì)。且研究表明，熱療時(shí)可調(diào)控包括抗原提呈細(xì)胞（APCs）、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）的活性[12-13]。熱刺激還可以導(dǎo)致壞死的腫瘤細(xì)胞釋放一些損傷相關(guān)的分子模式分子（damageassociated molecular pattern molecule，DAMP），誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，單獨(dú)冷療和熱療仍然存在一些局限性[14-15]，大大限制了兩者在臨床上的應(yīng)用。我們?cè)O(shè)計(jì)并研制了一套新型的液氮射頻冷熱交替熱物理治療系統(tǒng)[1]。在前期研究中，基于小鼠4T1乳腺癌裸鼠脊背視窗模型，發(fā)現(xiàn)冷熱交替治療相對(duì)于熱療或冷療對(duì)腫瘤新生血管具有更強(qiáng)的破壞能力[16]。另外建立了皮下高轉(zhuǎn)移性4T1小鼠乳腺癌模型，該腫瘤模型在生長(zhǎng)21 d即在脾臟、肺部形成微轉(zhuǎn)移灶[17]。經(jīng)過冷熱交替治療后，存活率明顯提高，且治療后無復(fù)發(fā)，小鼠血清內(nèi)Th1型細(xì)胞因子的含量明顯上升[18]，提示可能激起了機(jī)體的抗腫瘤免疫響應(yīng)。此免疫響應(yīng)不但使原位腫瘤消融，而且抑制了已經(jīng)存在的微轉(zhuǎn)移[19]。但目前對(duì)其治療機(jī)制還不清楚。

基于前期的研究，提出如下假說：通過應(yīng)用非極限溫度進(jìn)行冷熱交替局部刺激腫瘤組織，在短時(shí)間內(nèi)物理性地破壞大量腫瘤細(xì)胞和腫瘤微循環(huán)，釋放腫瘤特異性抗原而激活免疫相關(guān)因子，然后促進(jìn)遞呈細(xì)胞的活化和抗原傳遞，及外周淋巴結(jié)遷移，解除免疫細(xì)胞MDSCs對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫的抑制，從而協(xié)同激活機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫響應(yīng)，達(dá)到由腫瘤局部治療到全身系統(tǒng)性的治療的效果。本文以4T1乳腺癌為模型，研究腫瘤局部治療后，原位腫瘤的損傷及對(duì)外周血和脾臟中免疫抑制細(xì)胞MDSCs的影響。Micro-CT成像觀察腫瘤血管的損傷，蘇木素伊紅染色研究腫瘤組織壞死；流式細(xì)胞術(shù)分析外周血中MDSCs的改變以及免疫熒光研究脾臟中MDSCs浸潤(rùn)的變化；同時(shí)進(jìn)行治療后三個(gè)月的療效觀察，分析冷熱交替治療可能存在的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞系及主要試劑

6～8周齡SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠（上海斯萊克動(dòng)物中心），飼養(yǎng)在獨(dú)立換氣盒籠中，人工控制12小時(shí)晝夜變換光照。小鼠自由攝取60Co輻射滅菌的飼料及高溫滅菌水。小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞（上海市第一人民醫(yī)院饋贈(zèng)），培養(yǎng)在加有10%的新生胎牛血清（杭州四季清有限公司）及雙抗（100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素）（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）的RPMI1640培養(yǎng)基中（美國(guó)Hyclone公司）。超細(xì)沉淀硫酸鋇顆粒購(gòu)于上海澤文貿(mào)易有限公司。用于流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光的抗體FITC標(biāo)記的CD11b和PE標(biāo)記的Gr-1購(gòu)于Biolegend公司。蘇木素和伊紅溶液購(gòu)自上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑有限公司。

1.2 4T1乳腺癌模型的建立及腫瘤大小的測(cè)定

制備1×106U/ 0.1 mL 4T1細(xì)胞懸液置于冰上待用。按0.5 mL/100 g小鼠體重腹腔注射0.016 g/mL戊巴比妥鈉對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，在小鼠背部皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液。腫瘤接種21 d后，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，按如下公式計(jì)算：V (cm3) =π×腫瘤長(zhǎng)軸(cm) ×腫瘤短軸(cm) × 腫瘤高度(cm) / 6。隨機(jī)將荷瘤小鼠分為荷瘤對(duì)照組，溫?zé)峤M和冷熱交替治療組。

1.3 冷熱交替治療

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方案

在實(shí)驗(yàn)中共包括三組：荷瘤對(duì)照組、溫?zé)峤M和冷熱交替治療組。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：(1) 腫瘤血管損傷：治療1 h后，每組3只小鼠，比較不同組腫瘤血管的損傷；(2) 腫瘤組織病理分析：治療1 h后，每組3只小鼠，分析原位腫瘤組織損傷；(3) MDSCs的變化：治療24 d后，每組3只小鼠，流式細(xì)胞術(shù)分析外周血中MDSCs以及脾臟組織切片分析脾臟組織中MDSCs的變化；(4) 存活率：每組8只小鼠，治療后3個(gè)月觀察各組小鼠的生活狀態(tài)，分析小鼠存活時(shí)間。

1.3.2 冷熱交替治療系統(tǒng)

采用實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的冷熱交替治療系統(tǒng)[1]。該系統(tǒng)包括液氮制冷和射頻加熱兩個(gè)模塊，如圖1所示。在治療過程中，為了減小接觸阻抗并確保治療劑量的統(tǒng)一性，設(shè)計(jì)了專門適用于該系統(tǒng)的圓形探針，見圖2。并且此探針適合本實(shí)驗(yàn)的體表腫瘤模型[20]。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)過程

圖1 冷熱交替治療系統(tǒng)示意圖[1]Fig.1 Sketch of the alternate thermal system[1]

腫瘤接種21 d時(shí)進(jìn)行治療，治療前測(cè)量腫瘤體積，此時(shí)平均值為0.2 cm3。治療前，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為三組：荷瘤對(duì)照組、溫?zé)峤M和冷熱交替組。首先對(duì)需要治療的小鼠麻醉，然后用酒精和碘酊對(duì)腫瘤部位消毒。

治療時(shí)，探針貼在腫瘤表面，將一根測(cè)溫用的熱電偶插入腫瘤基底部。溫?zé)嶂委煵捎蒙漕l加熱，將腫瘤的溫度加熱至50oC(熱電偶所測(cè)的溫度)，并保持15 min。冷熱交替治療分為三個(gè)過程：(1)冷凍 用液氮致冷的方法將腫瘤溫度降至-20oC，保持5 min；(2)復(fù)溫 冷凍治療后，等待腫瘤自然復(fù)溫至10oC左右；(3) 加熱 復(fù)溫過程結(jié)束，射頻加熱將腫瘤溫度升至 50oC，保持10 min。治療完成后，將三組小鼠各分為4部分，用于不同的實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 冷熱交替治療探針[20]Fig.2 The treatment probe of alternate thermal system[20]

1.4 腫瘤新生血管觀察

利用微血管造影技術(shù)，以硫酸鋇為造影劑，Micro-CT成像，評(píng)價(jià)不同治療方式引起腫瘤血管的損傷程度。取超細(xì)沉淀硫酸鋇顆粒溶于0.3 g/ml的生理鹽水中，充分溶解后，用超聲波粉碎機(jī)超聲20 min以上得到合適的硫酸鋇造影劑待用。治療1 h后，小鼠麻醉，用硫酸鋇造影劑對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌注。灌注結(jié)束，將腫瘤取下，福爾馬林固定、干燥，Micro-CT(Xredia, MicroXCT-200, Inc., USA)成像。成像參數(shù)如下：管電壓，30 kVp；管電流，200 μA；分辨率，2.5 μm～3 μm；曝光時(shí)間，15 s；球管距離，35 mm；探測(cè)距離：24 mm；層厚，1.83 μm；層距，0；像素，0.001 83 mm；體素，1.83 μm × 1.83 μm×1.83 μm；掃描視野，1.78 mm ×1.78 mm。投影張數(shù)1 500張。重建得到三維結(jié)果。

1.5 蘇木素伊紅染色（HE）

將冷凍保存的各組腫瘤組織從-80oC冰箱取出，冰凍切片包埋劑（OCT）固定，沿著組織的矢狀線方向切片（LEICA CM1900），切片厚度為10 μm，冰凍切片重新保存在-80oC冰箱待用。HE染色時(shí)，首先將冰凍切片從-80oC冰箱取出，在自來水中浸泡5 min。然后在蘇木素溶液中浸染5 min，自來水反藍(lán)30 min后，伊紅浸染5 min。使用梯度酒精使組織脫水，二甲苯浸泡使之透明。最后使用中性樹膠封片，并正置在顯微鏡下觀察拍片。

1.6 免疫熒光

治療24 d后，將各組小鼠的脾臟取下，經(jīng)冷凍的異戊烷浸泡后，保存在-80oC冰箱待用。切片過程同1.5，脾臟冰凍切片重新保存在-80oC冰箱待用。免疫熒光染色時(shí)，將脾臟組織切片從-80oC冰箱取出，自然風(fēng)干后，在4oC丙酮中固定，經(jīng)過0.1% Triton X-100透膜以及5%牛血清白蛋白BSA封閉非特異性抗原，加入PBS（Phosphate Buffered Saline）稀釋的熒光一抗，置于4oC孵育過夜。避光吹干組織，加入含DAPI的防淬滅劑封片（VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI，Vector Laboratories）。封片后的組織避光保存，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5)觀察并拍照。

1.7 流式細(xì)胞分析

治療后24 d，眼球采血0.5 ml，加入0.9%氯化銨裂解液以裂解外周血中的紅細(xì)胞，離心收集小鼠外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。PBS重懸、清洗后，加入熒光抗體在4oC避光孵育30 min，再次PBS清洗。移入流式管，在流式細(xì)胞儀（BDFACS AriaTMII）上檢測(cè)并分析。

1.8 存活時(shí)間分析

治療后3個(gè)月觀察小鼠生活狀態(tài)，分析各組小鼠的存活時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 原位腫瘤血管的損傷

血管造影顯示對(duì)照組荷瘤小鼠中腫瘤血管豐富。腫瘤的邊緣存在一些大的血管分支，中心區(qū)域則有眾多的腫瘤新生血管叢，見圖3(a)。經(jīng)過溫?zé)嶂委熤螅[瘤中心和腫瘤邊緣的血管都顯著減少，見圖3(b)，腫瘤血管只存在于腫瘤基底部位和邊緣區(qū)域，并且血管形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，膨脹程度增加。圖3(c)顯示冷熱治療后血管破壞嚴(yán)重，幾乎不存在。表明熱物理治療能夠?qū)δ[瘤血管起到較嚴(yán)重的破壞作用，切斷對(duì)腫瘤氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給，而腫瘤冷熱交替治療比溫?zé)嶂委熜Ч语@著。

2.2 原位腫瘤組織的損傷

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論在腫瘤的中心區(qū)域和邊緣區(qū)域，相對(duì)于荷瘤對(duì)照組和溫?zé)峤M，冷熱交替治療造成了嚴(yán)重的組織壞死，其中尤與邊緣區(qū)域更為明顯，見圖4，細(xì)胞核（藍(lán)色）減少，壞死后出現(xiàn)的紅色間質(zhì)增多。

圖3 腫瘤新生血管損傷結(jié)果Fig.3 Tumor microvasculature lesion results

圖4 蘇木素伊紅染色腫瘤組織損傷Fig.4 Hematoxylin and eosin staining showed necrosis in tumor

2.4 外周血中免疫抑制細(xì)胞的變化

外周血是MDSCs分布的重要場(chǎng)所。治療24 d后（即接種45 d），荷瘤對(duì)照組小鼠出現(xiàn)大量死亡，為保證有完整的對(duì)照組，觀察最終冷熱交替對(duì)脾臟浸潤(rùn)免疫抑制細(xì)胞的作用，因此選取治療24 d分析外周血中MDSCs細(xì)胞的改變。圖5是小鼠流式檢測(cè)結(jié)果，MDSCs為CD11b+Gr-1+細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)可以定量分析出其所占PBMC的比例。治療后24 d，以正常組小鼠含量為基準(zhǔn)，對(duì)照組小鼠外周血中MDSCs所占百分顯著增加，達(dá)到28.7%。溫?zé)峤M與對(duì)照組相比有所下降，為19.6%，但也沒有達(dá)到正常小鼠的水平。冷熱交替治療后MDSCs恢復(fù)至正常水平。

2.5 脾臟中免疫抑制細(xì)胞解除

圖5 外周血中各組MDSCs的變化Fig.5 Flow cytometry detects MDSCs changing in PBMC of different groups

脾臟是小鼠重要的免疫器官，荷瘤小鼠脾臟中會(huì)浸潤(rùn)大量的免疫抑制細(xì)胞。治療24 d后，利用免疫熒光檢測(cè)脾臟中MDSCs細(xì)胞的改變。激光共聚焦的免疫熒光結(jié)果，見圖6，發(fā)現(xiàn)冷熱交替治療后脾臟中MDSCs數(shù)量顯著下降。與對(duì)照組相比，溫?zé)嶂委熀笃⑴K中的MDSCs也明顯減少，但依然存在一定數(shù)量的免疫抑制細(xì)胞，機(jī)體的免疫抑制并沒有被完全解除。

圖6 激光共聚焦顯微鏡的免疫抑制細(xì)胞熒光圖Fig.6 Confocal microscopy immuno fluorescence images of immune suppressive cells after the thermal treatments

2.6 腫瘤冷熱交替可以顯著提高存活率

對(duì)治療后的小鼠治療進(jìn)行3個(gè)月的觀察，每組8只小鼠。冷熱交替治療后，其中7只小鼠生活狀態(tài)良好，沒有發(fā)生任何體表轉(zhuǎn)移。對(duì)照組小鼠在接種后50 d內(nèi)全部死亡。溫?zé)嶂委熾m然能夠延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，但大部分小鼠在60 d內(nèi)死亡，只有1只在3個(gè)月內(nèi)沒有發(fā)生體表轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。因此，冷熱交替治療腫瘤可以極大的提高小鼠生存率，達(dá)到良好的治療效果。

3 總結(jié)和討論

本研究以4T1乳腺癌為模型，研究冷熱交替局部腫瘤治療后，原位腫瘤的損傷及對(duì)外周血和脾臟中免疫抑制細(xì)胞MDSCs變化及對(duì)療效的影響，分析冷熱交替治療腫瘤的可能的機(jī)制。研究結(jié)果表明，冷熱交替治療可以造成更嚴(yán)重的腫瘤血管破壞以及組織壞死。更重要的是解除了外周血和脾臟中的抗腫瘤免疫抑制，最終達(dá)到很好的治療效果。

冷熱交替治療所達(dá)到的較高的治療效果，主要?dú)w因于以下三個(gè)方面。首先，冷熱交替治療破壞大量的腫瘤血管。腫瘤血管在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中起到了重要的作用[21]，是許多腫瘤治療中的靶點(diǎn)。相對(duì)于熱療，冷熱交替治療對(duì)腫瘤血管產(chǎn)生更嚴(yán)重的破壞，降低了腫瘤細(xì)胞通過血管轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端的風(fēng)險(xiǎn)。其次，冷熱交替治療造成更嚴(yán)重的組織壞死，腫瘤細(xì)胞壞死可以釋放出具有促炎癥功能的DAMP[22-24]以及抗原肽，通過促進(jìn)腫瘤抗原的呈遞、激活DC細(xì)胞的活性并促進(jìn)其成熟的方式誘導(dǎo)抗腫瘤免疫[25]。同時(shí)，壞死組織釋放的抗原肽作為危險(xiǎn)信號(hào)使得殘留的腫瘤細(xì)胞對(duì)CTL的殺傷作用更敏感[26]。 再次，冷熱交替治療可以解除外周血和脾臟中MDSCs的聚集。MDSCs（CD11b+Gr1+）的增加是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志性特征[27]，可以抑制腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的功能，導(dǎo)致許多癌癥的不良預(yù)后[28]。近年來，免疫抑制細(xì)胞已經(jīng)成為腫瘤治療中新的靶點(diǎn)[29]。外周血和脾臟中MDSCs的降低預(yù)示著局部治療會(huì)解除機(jī)體全身的免疫抑制。

相比之下，盡管熱療也可以產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的壞死，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫[30-32]。但是治療過后，外周血和脾臟中MDSCs 的含量不能恢復(fù)至正常水平，即免疫抑制沒有完全解除。說明熱療激起的抗腫瘤免疫響應(yīng)不足以將殘留的腫瘤細(xì)胞全部殺死，導(dǎo)致治療過后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。另一個(gè)方面，熱療過后，腫瘤血管沒有被完全破壞，增加了殘留腫瘤細(xì)胞通過血管轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端的可能。

本研究以自主研發(fā)的冷熱交替治療儀為基礎(chǔ)，創(chuàng)新性的提出了冷熱交替治療腫瘤的治療方案。同常規(guī)的熱療相比較，冷熱交替治療可獲得較高的存活率。表明冷熱治療對(duì)于轉(zhuǎn)移性腫瘤具有很好的治療效果，該效果可能是由腫瘤的局部損傷引起了機(jī)體全身的抗腫瘤免疫響應(yīng)引起，是一種由局部到全身的治療方式，更多的機(jī)制將進(jìn)一步深入研究。冷熱交替有可能成為將來治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的新型熱物理治療方法。

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