孫 浩，舒 茂，趙雷修，周凡蕊

(1.西南林業(yè)大學(xué)理學(xué)院，昆明 650224;2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

氣味結(jié)合蛋白(Odorant Binding Proteins，OBPs)是在脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類嗅覺(jué)蛋白。它們是細(xì)胞外的較小的可溶性蛋白，位于感覺(jué)樹(shù)突周圍的液體中。通常認(rèn)為它可以捕捉氣味和信息素分子，并把它們轉(zhuǎn)運(yùn)到嗅覺(jué)受體上(Vogt et al.，1985;Pelosi and Maida，1990)。昆蟲(chóng)對(duì)信息素和其他氣味的感知是一系列復(fù)雜過(guò)程的結(jié)果，近年來(lái)的研究對(duì)這些過(guò)程進(jìn)行了很多闡述。脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物都通過(guò)它們的嗅覺(jué)系統(tǒng)來(lái)探測(cè)氣味，動(dòng)物的化學(xué)感覺(jué)對(duì)于覓食，交配，躲避有毒物質(zhì)和惡劣環(huán)境來(lái)說(shuō)是必要的(Li et al.，2008)。對(duì)于陸生動(dòng)物，大多數(shù)氣味都是空氣中的疏水小分子，它們必須穿過(guò)脊椎動(dòng)物的粘液、昆蟲(chóng)的感受器淋巴液等親水介質(zhì)才能到達(dá)嗅覺(jué)受體(Olfactory Receptors，ORs)(Jiang et al.，2009;Lagarde et al.2011)。這個(gè)克服親水介質(zhì)能壘的過(guò)程通常需要借助氣味結(jié)合蛋白(Odorant Binding Proteins，OBPs)來(lái)完成(Zhang et al.，2012)。氣味分子的轉(zhuǎn)運(yùn)是陸生動(dòng)物獨(dú)有的，就這一點(diǎn)而言，氣味結(jié)合蛋白(OBPs)從很大程度上體現(xiàn)了陸生動(dòng)物嗅覺(jué)系統(tǒng)的適應(yīng)性進(jìn)化(Vogt et al.，1991)。

在昆蟲(chóng)中OBPs 可以分成3種類型(Zhou et al.，2009;Spinelli et al.，2012)，分別是:信息素結(jié)合蛋白(Pheromone－Binding Proteins，PBPs)，一般氣味結(jié)合蛋白(General Odorant－Binding Proteins，GOBPs)和觸角特異性蛋白(Antennal Specific Proteins，ASPs)也稱為觸角結(jié)合蛋白x，(Antennal－Binding Proteinx，ABPx)。昆蟲(chóng)觸角上的感器淋巴液(Sensillum Lymph)中含有大量的OBPs(濃度高達(dá)10 mM)(Vogt and Riddiford，1981;Klein，1987;Vogt et al.，1989)。

一般認(rèn)為OBPs 的主要功能是識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)氣味分子。隨著研究的深入，人們又提出了OBPs 其他一些功能:(1)OBPs 可以作為清除劑，清除結(jié)合在受體上的信息素和其它外來(lái)信息素，以保持受體的活性(Kaissling，1986;Pelosi and Maida，1990);(2)在氣味分子濃度過(guò)高時(shí)，OBPs 可以作為過(guò)濾器來(lái)降低其濃度，避免發(fā)生受體長(zhǎng)期靈敏度降低的情況(Pelosi and Maida，1990;Zhong et al.，2012);(3)電生理學(xué)數(shù)據(jù)顯示多音大蠶蛾Antheraea polyphemus 的ApolPBPs和Bomby mori 的BmorPBPs 有助于嗅覺(jué)受體的激活。這種激活依賴于受體、PBP和信息素的三元締合物(Pophof，2004)。由此看來(lái)，OBPs 還會(huì)扮演受體活性激發(fā)者的角色，而不僅僅是被動(dòng)的運(yùn)輸者(Tegoni et al.，2004);(4)來(lái)自昆蟲(chóng)不同部位的OBPs 也意味著它們可能有不同的功能。

三維結(jié)構(gòu)在研究OBPs 的功能方面起著至關(guān)重要的作用。因?yàn)樵谄渌恍?shí)驗(yàn)中得出的看似正確的結(jié)論，后來(lái)卻被晶體結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)證明是錯(cuò)誤的(Mohanty et al.，2004)，所以只有掌握OBPs 的三維結(jié)構(gòu)才可以更加清楚明確的解釋或者推測(cè)OBPs的功能。目前在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的PBPs 的序列超過(guò)2000個(gè)，而PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中OBPs 的晶體結(jié)構(gòu)只有幾十個(gè)，這無(wú)疑對(duì)OBPs 的研究是一種障礙。不過(guò)隨著同源模建方法的提出，這一問(wèn)題被在一定程度上解決了。同源模建可以比較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)一個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，在一致性較高的情況下更是如此。

棉紅鈴蟲(chóng)Pectinophora gossypiella 是一種世界性棉花害蟲(chóng)，也是我國(guó)長(zhǎng)江流域錦花生產(chǎn)上的主要害蟲(chóng)之一。從三十年代起，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)錦紅鈴蟲(chóng)的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性以及防治技術(shù)等方面進(jìn)行了許多研究。

本文即是通過(guò)同源模建方法，預(yù)測(cè)棉紅鈴蟲(chóng)信息素結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行分析，為OBPs 的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 模版的選擇

根據(jù)棉紅鈴蟲(chóng) OBP 的一級(jí)序列(GI:6272642)，用BLAST 程序在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，尋找與其序列一致性較高的X 射線衍射晶體結(jié)構(gòu)。最終找到一系列評(píng)估值(Evalue)最趨近于零，且序列一致性較高的晶體結(jié)構(gòu)。從中選出分辨率較高的三個(gè)晶體作為模版分子，它們分別為:2P71(分辨率為2.0，Evalue 值為9e－53，A 鏈一致性為68.94%)、1DQE(分辨率為1.8，Evalue值為3e－55，B 鏈一致性為69.34%)和2P70(分辨率為2.1，Evalue 值為9e－53，A 鏈一致性為68.94%)。這三個(gè)晶體中，都是家蠶的信息素結(jié)合蛋白晶體。

1.2 結(jié)構(gòu)的模建

用Modeller 程序?qū)⒚藜t鈴蟲(chóng)的一級(jí)序列與模版分子的序列進(jìn)行比對(duì)(圖1)，然后根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行同源模建，生成1000個(gè)可能的結(jié)構(gòu)。在這些結(jié)構(gòu)中選取打分最優(yōu)的一個(gè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。目標(biāo)結(jié)構(gòu)的序列比模版結(jié)構(gòu)的序列長(zhǎng)，長(zhǎng)出的部分是結(jié)構(gòu)C－端和N－端的loop 區(qū)，長(zhǎng)出的部分由于沒(méi)有模版，所以它們的構(gòu)象是隨機(jī)的產(chǎn)生的，其意義不大。為了便于研究，將目標(biāo)結(jié)構(gòu)兩端多出的殘基刪去，僅保留中間的24～155 號(hào)殘基。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)

為了確定模建結(jié)構(gòu)的合理性，本文使用UCLA網(wǎng)站上的Procheck，Verify3D和ERRAT 三個(gè)程序和ProSa2003 對(duì)模建結(jié)構(gòu)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

2.1.1 Procheck 評(píng)價(jià)結(jié)果

Procheck 程序主要用于評(píng)價(jià)模型中殘基與殘基之間的立體化學(xué)性質(zhì)，用Ramachandran 圖(拉氏構(gòu)象圖)表示。在Ramachandran 圖(圖2)中，A、B、L 三個(gè)區(qū)域?yàn)楹侠韰^(qū)域;a，b，l，p 四個(gè)區(qū)域?yàn)檩^合理區(qū);～a，～b，～l，～p 為大體可以接受的區(qū)域;其余區(qū)域?yàn)椴缓侠韰^(qū)域。

甘氨酸和脯氨酸在Ramachandran 圖中的允許存在的范圍比較大，所以非甘氨酸、非脯氨酸殘基處于合理范圍內(nèi)的比例成為判斷結(jié)構(gòu)合理性的主要依據(jù)。目標(biāo)結(jié)構(gòu)中共含有119個(gè)非甘氨酸、非脯氨酸殘基，其中112個(gè)處于合理區(qū)域內(nèi)，約占總數(shù)的94.1%;6個(gè)處于比較合理的區(qū)域內(nèi)，約占總數(shù)的5.0%;1個(gè)處于大體可以接受的范圍內(nèi)，約占總數(shù)的0.8%;沒(méi)有非甘氨酸、非脯氨酸殘基處于不合理的區(qū)域內(nèi)。由此可以看出，目標(biāo)結(jié)構(gòu)總體上是合理的。

2.1.2 Verify 3D 評(píng)價(jià)結(jié)果

Verify3D 用于分析三維結(jié)構(gòu)(3D)與一級(jí)序列(1D)的兼容性。一個(gè)殘基3D－1D 的平均得分大于0.2 時(shí)為合理。由圖3 可以看出，目標(biāo)結(jié)構(gòu)所有殘基3D－1D 的平均得分都大于0.2，所以目標(biāo)結(jié)構(gòu)所有殘基都是合理的。

圖3 Verify3D 打分圖Fig.3 Verify3D scores model structure residues

2.1.3 ERRAT 評(píng)價(jià)結(jié)果

ERRAT 通過(guò)統(tǒng)計(jì)目標(biāo)結(jié)構(gòu)中不同原子間非鍵相互作用，并與高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)相比較，其誤差值在置信區(qū)間內(nèi)的區(qū)域被認(rèn)為是合理的區(qū)域，合理區(qū)域所占的百分比越高說(shuō)明結(jié)構(gòu)質(zhì)量越高。對(duì)于那些高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，這個(gè)百分比的平均值可以達(dá)到95%。由圖4 可以看出本文目標(biāo)結(jié)構(gòu)的百分比為100%，說(shuō)明目標(biāo)結(jié)構(gòu)的可靠性很高。

2.1.4 ProSa 2003 評(píng)價(jià)結(jié)果

ProSa2003 通過(guò)計(jì)算結(jié)構(gòu)的能量和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)(z－score)來(lái)判斷其合理性。從計(jì)算得到的能量曲線(圖5)上看，模建結(jié)構(gòu)各個(gè)殘基的能量均為負(fù)值，說(shuō)明模建結(jié)構(gòu)在能量方面是合理的。2P71、1DQE、2P70和模建結(jié)構(gòu)的z－score 分別為－10.17、－9.77、－9.82和－10.23。模建結(jié)構(gòu)的z－score 與模板結(jié)構(gòu)的相近，這同樣說(shuō)明了模建結(jié)構(gòu)的合理性。模建結(jié)構(gòu)的z－score 小于模板結(jié)構(gòu)的z－score 表明模建結(jié)構(gòu)比模板結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖4 ERRAT 計(jì)算的模建結(jié)構(gòu)殘基誤差值圖Fig.4 Error values of model structure residues

圖5 ProSa2003 計(jì)算的模建結(jié)構(gòu)各殘基的能量圖Fig.5 Energy of model structure residues

2.2 結(jié)構(gòu)分析

從同源模建的結(jié)構(gòu)(圖6)中可以看出，棉紅鈴蟲(chóng)信息素結(jié)合蛋白由6個(gè)α－螺旋和連接這些螺旋的回折構(gòu)成，其中5個(gè)α－螺旋(α1，α2，α4，α5，α6)構(gòu)成了錐形的疏水結(jié)合口袋的側(cè)壁，螺旋α3 處于錐形口袋的開(kāi)口的頂部。螺旋α1和α2間，α3和α4 間，以及α5和α6 間的回折形成的邊緣也位于錐形口袋的開(kāi)口的頂部。錐形口袋的窄端是由螺旋α4和α5 之間的回折，以及螺旋α6末端和C－端的回折共同構(gòu)成的。六個(gè)保守的半胱氨酸上的硫原子之間的距離為0.2 nm，處在二硫鍵鍵長(zhǎng)的范圍內(nèi)，說(shuō)明這六個(gè)半胱氨酸可以形成三個(gè)二硫鍵，從而對(duì)結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定的作用。

圖6 棉紅鈴蟲(chóng)信息素結(jié)合蛋白同源模建結(jié)構(gòu)Fig.6 Model structure of Pectinophora gossypiella

3 結(jié)論與討論

本文用同源模建方法構(gòu)建了棉紅鈴蟲(chóng)信息素結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)。從對(duì)結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)看，該結(jié)構(gòu)的具有很高的可靠性，在沒(méi)有晶體結(jié)構(gòu)的情況下，可以代替實(shí)驗(yàn)得到的晶體結(jié)構(gòu)對(duì)棉紅鈴蟲(chóng)信息素結(jié)合蛋白的性質(zhì)進(jìn)行分析，也可以作為分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬的基礎(chǔ)。從結(jié)構(gòu)看，棉紅鈴蟲(chóng)信息素結(jié)合蛋白的主要結(jié)構(gòu)是6個(gè)α－螺旋，其中五個(gè)構(gòu)成錐形的疏水口袋，可以結(jié)合信息素分子。六個(gè)保守的半胱氨酸可以形成三個(gè)二硫鍵，從而對(duì)結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定的作用。這些信息為棉紅鈴蟲(chóng)信息素結(jié)合蛋白的深入研究打下了基礎(chǔ)，為相關(guān)農(nóng)藥的研究提供有意義的借鑒，最終為農(nóng)林蟲(chóng)害的防治提供幫助。

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