王昱超，穆常青，郭曉軍，王 甦，田兆豐，姚 晶，羅 晨*，孫躍先

(1.云南農(nóng)業(yè)大學植保系，昆明 165020;2.北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097;3.北京市植物保護站，北京 100029)

煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)屬半翅目Hemiptera 粉虱科Aleyrodidae 小粉虱屬Bemisia，是農(nóng)業(yè)及園藝作物的主要害蟲之一。煙粉虱除通過取食寄主汁液、分泌蜜露造成植物危害外，傳播多種植物病毒也是重要方式之一(Brown，1994;Jone，2003)。研究表明，目前全世界已知報道煙粉虱有至少35個隱種，其中 MED(Mediterranean)(Q 型)和MEA1(Middle East－Asia Minor 1)(B 型)是入侵我國重要的煙粉虱隱種，?；旌习l(fā)生，并對我國農(nóng)業(yè)造成了不同程度的危害和損失(De Barro et al.，2011;Hu et al.，2011)。而MED 自2006年入侵我國后，危害更為嚴重、寄主譜更廣、易產(chǎn)生抗藥性，且傳播雙生病毒，防治上更為困難(褚棟等，2005;Luo et al.，2010)。

番茄黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus，TYLCV)是世界范圍內流行的一種毀滅性雙生病毒，首次在我國報道檢測出后，在我國番茄主要產(chǎn)區(qū)流行發(fā)生，并造成嚴重經(jīng)濟損失(Wu et al.，2006)。研究表明，MED 是雙生病毒傳播的重要媒介，除在植物與煙粉虱之間直接傳播外，還可通過煙粉虱交配及產(chǎn)卵攜帶等方式在個體和代別間進行傳播(糾敏等，2006;Brown，2010)。TYLCV 對MED 生理學影響的研究，僅見報道有關于帶毒植株對煙粉虱的產(chǎn)卵量影響，MED 在發(fā)病番茄上的產(chǎn)卵量比健康番茄上略高，但結果差異不顯著(李萌等，2010)。通過直接觀察感染TYLCV 后煙粉虱取食行為的影響和變化的研究，鮮有報道。

煙粉虱作為一種刺吸式口器昆蟲，其在口針刺入植物體內后，在外部很難知道其具體的取食行為及變化。刺吸電位技術(Electrical penetration graph，EPG)的運用，為研究昆蟲口器在寄主體內的取食及相關行為提供了較好的技術手段(McLean et al.，1965;Kimmins et al.，1985;湯清波等，2011;趙秋劍等，2011)。目前，EPG 技術在蚜蟲取食行為的研究領域，獲得了非持久性病毒pd 波的分析。棉蚜獲毒發(fā)生在pd 波的Ⅱ－3 階段，支持了蚜蟲獲毒的“吸入假說”，且pdⅡ－2的持續(xù)時間可以作為棉蚜傳毒的指標(張鵬飛等，2001;王斌等，2003;Tjallingii et al.，2010)。EPG技術在煙粉虱取食行為的研究起步較晚，Johnson等(1999)比較了煙粉虱與蚜蟲pd 波的差異，發(fā)現(xiàn)了一些不同，成功將EPG 技術應用到煙粉虱的研究。Jiang 等(1999)則將MED和MEA1 的取食波形進行了比較，發(fā)現(xiàn)其在一些與韌皮部有關的參數(shù)上存在差異。而后的研究結果多集中在不同隱種煙粉虱對寄主植物適應性以及寄主植物抗性等方面。目前，關于煙粉虱和雙生病毒的協(xié)同進化研究正在逐步成為熱點。本文利用EPG 技術研究了感染和未感染TYLCV 的MED 隱種在番茄上的取食波形差異，并對煙粉虱取食行為不同階段的時間評價指標結果進行了比較和分析，探究TYLCV 對煙粉虱取食行為的影響，為深入研究煙粉虱—寄主植物—病毒三者間的相互關系奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物和昆蟲

供試番茄Lycopersicon esculentum Mill.品種為仙客6 號，購于北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心，田間觀察為對TYLCV 敏感。恒溫箱內培育凈苗(26±0.3℃、RH60%±5%，光照L∶D=14∶10)，長至3～4片真葉時用于試驗。

煙粉虱采自于北京市農(nóng)林科學院溫室，室內置于籠內以無毒番茄植株飼養(yǎng)續(xù)代，所獲種群經(jīng)鑒定為MED 隱種。利用感病番茄植株獲得感染TYLCV 的MED種群，實驗所用帶毒煙粉虱均為感病番茄飼養(yǎng)48 h 后的煙粉虱，方法為:將有偽蛹的葉片剪下，置于有濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，待羽化后，將初羽化的煙粉虱放入養(yǎng)蟲籠內取食獲毒。

1.2 EPG 記錄

成蟲的EPG 試驗主要分為四個步驟:第一步是將金絲粘連到銅釘上，金絲直徑為12 μm;第二步是將粉虱固定在培養(yǎng)皿底部;第三步是用金絲粘連粉虱;第四步是放置粉虱。各步驟詳見岳梅等(2005)。將煙粉虱放置于葉片背面，將銅釘插入探頭，開始試驗記錄。每頭粉虱只用于一個記錄，每株植株僅用一次，感染和不感染TYLCV 的MED 隱種試驗個數(shù)分別為60和40頭，記錄時間為6 h。

EPG 信號放大器為荷蘭瓦格寧根大學昆蟲學實驗室研制的Giga－4 型放大器，負責把從探頭進來的電信號轉換為數(shù)字信號的是一個轉換器(DI－720，DATAQ INSTRUMENTS)，連于放大器和電腦之間支持軟件為轉換器自帶的分析軟件(WINDAQ)。刺探電位信號首先記錄、保存到計算機硬盤上，然后用分析軟件對波形進行識別和分析。

煙粉虱傳毒主要在韌皮部刺吸的過程，其口針在不同部位對應的EPG 波形也各不相同。EPG各種波形的生物型意義參見高慶剛等(2006)。本實驗將整個紀錄過程分為三個階段:第一階段從刺吸開始到第一個E1(韌皮部分泌波形)出現(xiàn);第二階段從第一個E1出現(xiàn)到第一次韌皮部持續(xù)取食;第三階段從第一次韌皮部持續(xù)取食到取食結束，選取12個指標進行分析，具體方法參見岳梅(2005)。

1.3 煙粉虱帶毒檢測

EPG 試驗過后對單頭煙粉虱分別進行TYLCV帶毒檢測，鑒定方法采用田兆豐等(2011)的方法。PCR 檢測步驟如下:首先提取昆蟲DNA 作為PCR反應體系的模板，采用1.5mL 的離心管依次加入ddH2O 25μL、10 X buffer 5μL、蛋白酶K 1.2μL、吐溫20 0.225μL和NP40 0.225μL 后研磨煮沸離心的方法。PCR 擴增引物序列為:Primer 1:5'－CCA ATA AGG CGT AAG CGT GTA GAC－3'Primer 2:5'－ACGCATGCCTCTAATCCAGTGTA－3';PCR 擴增體系:模板1μL、Primer 1 1μL、Primer 2 1μL、2×Master Mix 10.51μL，加ddH2O 至體積為20μL。PCR反應程序:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。反應完畢后，從PCR 產(chǎn)物中取5μL 電泳檢查擴增結果，合成序列大小應為500 bp 左右。

1.4 統(tǒng)計分析

應用統(tǒng)計軟件為SPSS16.0 for windows。感染和未感染TYLCV 的MED 隱種在番茄上的取食差異利用獨立樣本的T 檢驗，兩組的顯著性差異均設為P=0.05 水平。

2 結果與分析

2.1 煙粉虱的病毒檢測結果

從電泳結果可看出，用于實驗的感染TYLCV的MED 隱種均能檢測到為500 bp 左右的PCR 產(chǎn)物，而未感染病毒的煙粉虱均檢測不到相應條帶(圖1)。

圖1 MED 煙粉虱帶毒檢測結果Fig.1 Detection of virus from MED Bemisia tabaci

2.2 煙粉虱的波形結果

煙粉虱的波形共記錄到6種，分別A、B、C、E、pd和np 波(圖2)，典型波形見岳梅等(2005)。

煙粉虱口針位于表皮和韌皮部之間的取食行為比較結果如表1。帶毒和不帶毒的煙粉虱的平均刺探次數(shù)和短于2 min 的平均刺探次數(shù)，即口針在刺探過程中進入葉肉細胞的次數(shù)沒有顯著的差異;而非刺探時間所占的比例，即在到達韌皮部之前非刺探行為占整個取食時間的比例，帶毒和不帶毒MED 分別平均為92%和76%，沒有顯著差異(P=0.187)。口針第一次到達韌皮部所用時間，帶毒和不帶毒MED 平均為135 min和26 min，差異非常顯著(P=0.001)。從口針開始刺探至到達韌皮部，帶毒MED 平均用時為46 min，要明顯的長于不帶毒MED 平均時間20 min。

圖2 煙粉虱典型波形(a)非刺探波形與C 波的轉換(50×);(b)路徑波C 與E 波的轉換(50×);(c)韌皮部分泌唾液波形E1(1×);(d)韌皮部取食波形E2(1×)。Fig.2 Representative EPG waveform of B.tabaci(a)Transform between waveform non－pierce and C(50×);(b)Trarsform between waveform C and E(50×);(c)Secretion waveform E1 on phloem(1×);(d)Feeding waveform E2 on phloem(1×).

表1 感染和未感染病毒的煙粉虱在植株上從刺探開始到第一次到達韌皮部的過程Table 1 Probing and feeding behaviors of Bemisia tabaci infected and uninfected with TYLCV from the start of penetration to achieving phloem on tomato

煙粉虱口針第一次到達韌皮部至第一次韌皮部持續(xù)取食階段結果如表2。不帶毒MED 中有19頭可以在韌皮部持續(xù)取食;而帶毒MED 有15頭可以在韌皮部持續(xù)取食。這一階段所用平均時間，帶毒MED 的平均時間(34 min)要長于不帶毒MED(14 min)，且具有顯著的差異(P=0.002)。在整個紀錄中從記錄開始至第一次韌皮部持續(xù)吸食所用的平均時間，即吸食之前口針刺探與非刺探的時間，兩者具有顯著差異(P=0.001)，帶毒MED 的平均時間(143 min)，而不帶毒MED 平均時間僅為26 min。同時，第一次持續(xù)吸食前的韌皮部唾液分泌總平均時間，帶毒MED(9 min)要長于不帶毒MED(3 min)，差異顯著(P=0.021)。

煙粉虱在第一次韌皮部持續(xù)吸食到取食行為結束階段結果如表3。帶毒MED 取食平均時間(15 min)顯著(P=0.001)長于未帶毒MED(4 min)。兩者在第一次到達韌皮部即能持續(xù)吸食(即第一次韌皮部分泌唾液后就取食)的煙粉虱比例、第一次韌皮部持續(xù)吸食后，韌皮部取食時間所占取食總時間的百分比和第一次韌皮部持續(xù)吸食后的刺探次數(shù)這四項參數(shù)均沒有表現(xiàn)出顯著差異。

表2 感染和未感染病毒的煙粉虱在植株上從第一次到達韌皮部至第一次韌皮部持續(xù)吸食的過程Table 2 Probing and feeding behaviors of Bemisia tabaci infected and uninfected with TYLCV from the 1st phloem phase to the 1st sustained phloem ingestion on tomato

表3 感染和未感染病毒的煙粉虱在植株上從第一次韌皮部吸食至取食結束的過程Table 3 Probing and feeding behaviors of Bemisia tabaci infected and uninfected with TYLCV from 1st sustained phloem ingestion to the end of feeding on host plants

3 結論與討論

關于植物病毒的研究往往局限于研究病毒引起植物生理行為的改變，從而間接改變傳毒昆蟲介體的趨向性。植物感染番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)會吸引西花薊馬雌成蟲的取食和產(chǎn)卵，但是，病毒也會對昆蟲本身的取食行為產(chǎn)生影響(Stafford et al.，2011)。利用EPG 研究帶毒MED 取食波形的結果表明:帶毒MED 完成一次取食行為的總時間較未帶毒MED 的時間顯著增長，主要表現(xiàn)在非刺探時間和韌皮部分泌取食階段時間的顯著差異。

在非刺探階段，帶毒與不帶毒MED個體取食過程中，平均刺入葉肉細胞的次數(shù)沒有顯著差異，但在口針穿過表皮—葉肉組織平均時間顯著長于不帶毒個體。而已有研究結果表明:到達韌皮部前的刺探次數(shù)與植物表皮—葉肉組織的抗性有關(Gabrys et al.，1997)，因此可以排除寄主植物物理抗性對非刺探行為的影響。根據(jù)Cohen(1998)的研究，煙粉虱取食時其所有的唾液鞘都伸向維管束，98% 的唾液鞘抵達了小葉脈;嚴盈等(2008)煙粉虱在韌皮部順利取食必須要在篩管外形成唾液鞘來抑制植物的蟲傷反應，以達到順利取食的目的。以上研究結合帶毒MED 非韌皮部刺探時間的延長，均表明TYLCV 對煙粉虱在健康番茄上口針由葉表到韌皮部的刺探過程可能具有不利作用的，可能是影響了其唾液鞘的形成。但是Stafford 等(2011)得出感染TSWV 的薊馬在非韌皮部刺探時間增長能夠促進TSWV 的傳播，表明非韌皮部刺探時間的延長可能促進了TYLCV 的傳播。

在韌皮部吸食階段，帶毒MED個體的各指標平均用時均長于不帶毒MED個體。唾液分泌總平均時間與煙粉虱的傳毒有較高的關聯(lián)性，主要表現(xiàn)在煙粉虱體內的病毒伴隨唾液進入了植物韌皮部內，而回歸分析表明傳毒效率與韌皮部分泌波形的總數(shù)目和波形持續(xù)時間高度關聯(lián)，并認為含有韌皮部唾液分泌波形和韌皮部持續(xù)吸食波形持續(xù)時間與次數(shù)增加，具有較高的傳毒效率(Jiang等，2000)。本試驗驗證了帶毒煙粉虱個體韌皮部分泌波形平均持續(xù)時間顯著長于不帶毒煙粉虱個體。在對柑橘木虱的傳毒研究中，黃龍病也具有韌皮部限制性，韌皮部分泌和取食波形的變化能夠影響病毒的獲得和傳播(Bonani et al.，2010)。在韌皮部取食階段，第一次韌皮部持續(xù)吸食所用平均時間，帶毒MED 平均用時顯著長于不帶毒MED。可以看出韌皮部分泌和取食波形與傳毒效率的提升有很重要的相關性。而本試驗得出帶毒MED 韌皮部取食波形平均時間顯著長于不帶毒MED，即韌皮部取食平均時間長于不帶毒煙粉虱個體，更利于病毒在煙粉虱在植物體內的傳播。因此，從本研究結果判斷，TYLCV 能夠使煙粉虱個體在韌皮部持續(xù)吸食時間增長，有利于煙粉虱種群的擴大;而煙粉虱種群的擴大則更有利于病毒的擴散傳播。

對非韌皮部階段MED 口針活動的推測需要結合口針切片或蜜露分析技術，并且對非韌皮部指標進行更詳細的分析，才能得出準確的結論。

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