趙 貝，李鴻儒，杜鋼軍

（河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004）

皂角刺又稱皂刺、天丁、皂針等，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，來源廣泛、價(jià)格低廉、作用多樣化且療效確切，毒副作用小，已被列為抗癌中草藥之一［1］。雖然皂角刺可以從多個(gè)層面、多個(gè)環(huán)節(jié)、多個(gè)部位發(fā)揮作用，能消腫脫毒、妒乳、風(fēng)癘惡瘡、排膿、殺蟲［2］。歷代醫(yī)家［3］認(rèn)為，腫瘤的形成與陽氣不足、陰寒凝滯、氣滯血瘀等有關(guān)。如《靈樞·百病始生篇》云：“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣”。皂角刺在改善癌癥患者食欲下降、高度乏力消瘦、抵抗力弱等陰盛陽衰癥狀方面未見報(bào)道。而肉桂性大熱，味辛、甘，補(bǔ)元陽，暖脾胃，除積冷，通血脈，可以補(bǔ)火助陽、引火歸源、散寒止痛、活血通經(jīng)，且肉桂中的肉桂醛和肉桂酸具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［4］。我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖强疾煸斫谴搪?lián)合肉桂藥酒相比皂角刺及肉桂藥酒單獨(dú)治療，在改善荷瘤小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)和抗腫瘤方面是否有更大的優(yōu)勢(shì)，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

皂角刺和肉桂，購自開封市天濟(jì)大藥房，經(jīng)河南大學(xué)中藥研究室鑒定為真品。皂角刺黃酒提取物、肉桂黃酒提取物、肉桂皂角刺（1∶1）復(fù)方黃酒提取物，含藥量均為10%。浸泡1周，紗布過濾，供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用；無菌過濾濾液供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用。

RPMI1640培養(yǎng)基、MTT、ConA（購自Sigma公司）；青霉素、鏈霉素（華北制藥集團(tuán)公司產(chǎn)品）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品）；小鼠Col－I、PAF、TIMP－I酶聯(lián)免疫試劑盒（R＆D Systems產(chǎn)品）；CAT 測(cè)定試劑盒、T－SOD 測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 動(dòng)物及瘤株

BALB／c小鼠，雌性，體質(zhì)量24～26g，河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK豫2010－1－0002）；4T1 乳腺癌瘤株由中科院生物物理研究所梁偉教授惠贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)室于Balb／c 小鼠在體傳代保存。

1.3 主要儀器

ElX800酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO－IEK）；LGR16－W 高速冷凍離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；電子天平FA1004N（上海精密儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（NAPCO 公司）；DYY－7C電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化，調(diào)細(xì)胞數(shù)5×104個(gè)／mL，以100μL／孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入含不同濃度皂角刺及其復(fù)方藥酒的培養(yǎng)基100μL／孔，每組5個(gè)復(fù)孔（見表1）。48h后，除去培養(yǎng)基，加含MTT 0.5g／L的PBS，100μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后除去孔內(nèi)液體，加入DMSO 100μL／孔，振蕩10min，在酶標(biāo)儀上570nm 處測(cè)吸光度（OD ），按下列公式計(jì)算抑制率［5］。

抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD 值／對(duì)照組OD值）×100%。

2.2 對(duì)4T1小鼠乳腺癌皮下移植腫瘤的影響

參照文獻(xiàn)［6］方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1 小鼠乳腺癌細(xì)胞，無菌生理鹽水調(diào)細(xì)胞數(shù)1×107個(gè)／mL，每只小鼠右腋部皮下接種0.2mL。接種后將小鼠按體質(zhì)量分為4組：①對(duì)照組灌胃黃酒；②肉桂組灌胃肉桂黃酒提取物；③皂角刺組灌胃皂角刺黃酒提取物；④聯(lián)合治療組灌胃肉桂皂角刺復(fù)方黃酒提取物（取肉桂、皂角刺按1∶1比例配置）。每組10只。實(shí)驗(yàn)次日開始隔天監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量1 次，以20mL／kg 給藥，2次／d，給藥間隔為8h，連續(xù)24d。每日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，待腫瘤長(zhǎng)出后用游標(biāo)卡尺隔天測(cè)腫瘤的長(zhǎng)度和寬度1次。腫瘤體積（mm3）＝腫瘤長(zhǎng)度×腫瘤寬度×腫瘤寬度／2。

實(shí)驗(yàn)25d頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)×鰤K、肝臟、胸腺和脾臟，按下列公式計(jì)算抑瘤率、肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

臟器指數(shù)（mg／g）＝內(nèi)臟器官質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）；腫瘤抑瘤率（%）＝（1－T／C）×100%。

式中：C為對(duì)照組平均瘤質(zhì)量（g）；T為實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量（g）。

2.3 對(duì)小鼠乳腺癌4T1肺轉(zhuǎn)移的影響

將接種25d左右生長(zhǎng)良好的4T1小鼠實(shí)體瘤研磨稀釋成細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)／mL，以0.2 mL／只尾靜脈注射于30只雌性BALB／c小鼠體內(nèi)，建立乳腺癌實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型［7］。分組與給藥同“2.1”。實(shí)驗(yàn)25d眶靜脈取血分離血清用于檢測(cè)Col－I、PAF、TIMP－1、CAT和T－SOD，然后處死小鼠，剝離出肺組織初步觀察轉(zhuǎn)移灶并計(jì)算肺上結(jié)節(jié)數(shù)。

2.4 對(duì)肺轉(zhuǎn)移小鼠血清中酶的影響

將“2.2”中的小鼠血液樣本，放置4 h 后離心，－20℃?zhèn)溆?。臨用前平衡至室溫，按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，測(cè)定荷瘤小鼠血清中Col－I、TIMP－1、PAF、CAT和T－SOD的水平。

2.5 對(duì)肺轉(zhuǎn)移小鼠基質(zhì)金屬酶譜的影響

將“2.3”中的肺組織進(jìn)行蛋白提取，將提取的蛋白進(jìn)行明膠酶譜法電泳實(shí)驗(yàn)。模具準(zhǔn)備安裝好后制備灌注分離膠和濃縮膠，待膠凝固后置入電泳槽中，加入電泳緩沖液，用樣品處理液處理蛋白后以20μL／孔加樣。濃縮時(shí)80 V，到分離膠時(shí)可加大至100V，至溴酚藍(lán)指示劑遷移至下緣時(shí)停止電泳。將膠剝離至含洗脫液（2.5% Triton X－100，50mmol／L Tris－HCl，5 mmol／L CaCl2，pH7.6）的培養(yǎng)皿中振蕩洗脫2次，每次1h，然后用漂洗液（除不含Triton X－100 外，其余同洗脫液）漂洗2次，每次20min，將凝膠置于孵育液中37℃孵育12～16h。孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色4h，倒掉染色劑，清水沖洗，倒入脫色液脫色2～3次至藍(lán)色背景和白色條帶清晰為止，顯示出MMP－2（72KDa）和MMP－9（92KDa）為位于藍(lán)色背景上的透亮帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 結(jié)果

4.1 對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響

肉桂及皂角刺對(duì)4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞均沒有直接殺傷作用，當(dāng)二者聯(lián)合使用，濃度達(dá)到50mg／L 時(shí)對(duì)其增殖有弱抑制作用，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

4.2 對(duì)4T1皮下移植及肺轉(zhuǎn)移小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響

對(duì)4T1皮下移植小鼠體質(zhì)量、瘤體積、瘤質(zhì)量、抑瘤率及免疫器官的影響，見圖1、圖2、表2；對(duì)4T1肺轉(zhuǎn)移小鼠體質(zhì)量、肺轉(zhuǎn)移率、血清中酶表達(dá)及基質(zhì)金屬酶譜的影響見表3、表4、圖3、圖4。

圖1 皮下移植模型小鼠體質(zhì)量生長(zhǎng)曲線

圖2 小鼠皮下移植瘤體積生長(zhǎng)曲線

表1 不同濃度藥物對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞增殖的影響比較

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量、抑瘤率及臟器指數(shù)比較（）

表3 各組小鼠肺轉(zhuǎn)移情況比較（）

表4 各組小鼠血清中Col－I、TIMP－I、PAF、CAT、T－SOD表達(dá)比較（）

圖3 肺轉(zhuǎn)移模型小鼠體質(zhì)量生長(zhǎng)曲線

圖4 對(duì)MMP－2及MMP－9的影響

5 討論

我們從整體、細(xì)胞、分子3個(gè)水平考察了皂角刺、肉桂單獨(dú)及聯(lián)合運(yùn)用對(duì)4T1小鼠乳腺癌皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)移的抑制作用，皂角刺聯(lián)合肉桂能協(xié)同抑制小鼠4T1乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，抑瘤率為46.19%，肺轉(zhuǎn)移率降至67.72%，并可改善皂角刺單獨(dú)用藥導(dǎo)致的荷瘤小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)下降。實(shí)驗(yàn)所用皂角刺及肉桂藥酒濃度均不能抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖，當(dāng)二者聯(lián)合使用，濃度達(dá)50 mg／L 時(shí)，可表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移發(fā)生的最關(guān)鍵一步是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜（BM）的降解。Col－I是細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，因而大量表達(dá)的Col－I對(duì)于腫瘤的轉(zhuǎn)移是抑制的［8］。瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與其誘導(dǎo)產(chǎn)生MMPs降解ECM、BM的能力密切相關(guān)，且在許多腫瘤中呈高表達(dá)［9］。而結(jié)合并抑制MMPs的活性是TIMP的重要功能之一。TIMP的過度表達(dá)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［10］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，皂角刺聯(lián)合肉桂能使Col－I表達(dá)顯著增多，MMP－2、MMP－9表達(dá)降低，且肉桂可逆轉(zhuǎn)皂角刺單獨(dú)治療造成的TIMP－I表達(dá)降低。皂角刺聯(lián)合肉桂可通過調(diào)節(jié)COL－MMPs－TIMP通路保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮抗轉(zhuǎn)移作用。

有研究［11］顯示，腫瘤患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的程度與其高凝狀態(tài)的程度密切相關(guān)。腫瘤與氧自由基及抗氧化系統(tǒng)之間呈相互作用，氧自由基水平的增高以及細(xì)胞抗氧化酶活性的改變可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肉桂可補(bǔ)充皂角刺在抗血栓方面的不足，增強(qiáng)其抗氧化方面的作用。

綜上所述，皂角刺聯(lián)合肉桂具有更強(qiáng)的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用?？鼓[瘤作用可能與其抗血栓、抗氧化及一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用有關(guān)，其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要是通過保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的。

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